Κοροναϊός του σκύλου (Canine Corona Virus, CCoV): διερεύνηση της παρουσίας του στην Ελλάδα και μοριακός χαρακτηρισμός του

Abstract

Ο κοροναϊός του σκύλου (canine coronavirus, CCoV) θεωρείται ένας από τους κύριους αιτολογικούς παράγοντες οξείας διάρροιας των σκύλων, ιδιαίτερα των νεαρών. Αποτέλεσμα της έντονης γενετικής ποικιλομορφίας που χαρακτηρίζει τον εν λόγω ιό ήταν η εμφάνιση δύο ξεχωριστών τύπων κοροναϊού, του τύπου Ι και του τύπου ΙΙ. Πρόσφατα, ο τύπος ΙΙ χωρίστηκε σε δύο νέους υποτύπους, τον IIa, στον οποίο κατατάσσονται τα κλασικά στελέχη και τον ΙΙb, στον οποίο ανήκουν στελέχη που αναδύθηκαν μετά από ανασυνδυασμό με τον ιό της μεταδοτικής γαστρεντερίτιδας του χοίρου. Τα τελευταία χρόνια ανιχνεύθηκαν στελέχη ιδιαίτερου ενδιαφέροντος, τα οποία έχουν τη δυνατότητα να διαπερνούν τον εντερικό φραγμό, προκαλώντας συστηματική μόλυνση στα ζώα. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της παρουσίας του κοροναϊού του σκύλου στην Ελλάδα, ο μοριακός χαρακτηρισμός των στελεχών που κυκλοφορούν, καθώς και η διαπίστωση της ύπαρξης στελεχών που ανιχνεύονται στα ζώα πέραν του εντερικού επιθηλίου. Για το σκοπό αυτό διενεργήθηκε δειγματοληψία κοπράνων και οργάνων από σκύλους με οξεία διάρροια από το )εκέμβρη του 2007, η οποία διάρκεσε δύο χρόνια. Τα δείγματα προέρχονταν από κυνοκομεία, καταστήματα πώλησης ζώων συντροφιάς και κλινικές ζώων. Η εξέταση των δειγμάτων έγινε με χρήση των μεθόδων RT-PCR και real time (RT-) PCR με στόχο την ανίχνευση και το χαρακτηρισμό του CCoV στα κόπρανα και τα όργανα των σκύλων. Παράλληλα, με αλληλούχηση τμημάτων του γονιδιώματος του ιού, έγινε μοριακή και φυλογενετική ανάλυση των στελεχών. Το ποσοστό του CCoV που ανιχνεύθηκε σε ζώα με οξεία διάρροια ήταν υψηλό (65,05%). Ο ιός ανιχνεύθηκε, επίσης, στο 77,34% των σκύλων που διαβιούσαν ομαδικά και στο 55,13% των σκύλων που διαβιούσαν ατομικά. Σε σκύλους ηλικίας κάτω των 3 μηνών ανιχνεύτηκε στο 73,63% αυτών, ενώ σε σκύλους ηλικίας 3 μηνών και άνω στο 58,26%. Μετά από το μοριακό χαρακτηρισμό των ιών διαπιστώθηκε η 2 παρουσία των δύο τύπων και των δύο υποτύπων στην Ελλάδα. Στην πλειοψηφία των θετικών ζώων ανιχνεύθηκαν μεικτές μολύνσεις (47,01%), με παρόντες περισσότερους του ενός τύπους ή υποτύπους. Παράλληλα διαπιστώθηκε η παραλλακτικότητα μεταξύ των στελεχών καθώς και η ύπαρξη ενός στελέχους που προέρχονταν από ανασυνδυασμό μεταξύ των δύο τύπων (THr/85/08). Επιπλέον, σε τρεις σκύλους ανιχνεύθηκαν στελέχη που διαπερνούν τον εντερικό φραγμό, ένα εκ των οποίων χαρακτηρίστηκε ως CCoVIIa (NA/09) και δύο ως CCoVIIb (66/09, 68/09). Τα δύο CCoVIIb στελέχη απομονώθηκαν στη συνεχή κυτταρική σειρά Α72. Από τη συγκεκριμένη μελέτη γίνεται εμφανής η παρουσία και η συχνότητα με την οποία εμφανίζεται ο CCoV σε ζώα με οξεία διάρροια στην Ελλάδα. Επιπλέον, υποδηλώνεται η συχνότερη εμφάνισή του σε ζώα που διαβιούν ομαδικά, καθώς και σε κουτάβια. Παράλληλα, από το χαρακτηρισμό αποδεικνύεται η συχνή εμφάνιση μεικτών μολύνσεων στην Ελλάδα και η συμμετοχή σε αυτές όλων των πιθανών συνδυασμών των τύπων και των υποτύπων του CCoV, με τις I/IIa/IIb μολύνσεις, να αναφέρονται για πρώτη φορά διεθνώς. Τα ελληνικά στελέχη εμφανίζουν έντονη παραλλακτικότητα, με τη μεγαλύτερη να αφορά στον τύπο Ι. Επιπλέον, έγινε σαφής η παρουσία αποκλίνοντος (ED/99/08/GR) αλλά και ανασυνδυασμένου (THr/85/08) στελέχους, ενισχύοντας τη θεωρία της έντονης γενετικής εξέλιξης και ποικιλομορφίας των κοροναϊών. Τέλος, διαπιστώθηκε η παρουσία στελεχών που διαπερνούν τον εντερικό φραγμό και στην Ελλάδα, τα οποία ομοιάζουν σε υψηλό ποσοστό με τα στελέχη αναφοράς. Για πρώτη φορά γίνεται ανίχνευση στελέχους του CCoVIIa στο πάγκρεας και στην καρδιά, ενώ όσον αφορά στα CCoVIIb στελέχη, παρουσιάζεται αναλυτικά για πρώτη φορά η κατανομή τους στα όργανα. Η απομόνωση των ανασυνδυασμένων TGEV-like στελεχών, δίνει τη δυνατότητα περαιτέρω έρευνας, σχετικά με την παθογένεια, καθώς και την κάλυψη των ζώων έναντι αυτών, μετά από χρήση του εμπορικού εμβολίου.

Canine coronavirus (CCoV), is an aetiologic agent of acute diarrhoea in dogs and especially puppies. Due to the genetic variability, nowdays CCoV is classified in two distinct types, type I and II. Moreover, recently, type II was devided in two new subtypes, encompassing the classical strains (CCoVIIa) and the new strains, emerging as a result of recombination among CCoV and transmissible gastroenteritis virus (CCoVIIb). In addition, during the last years, strains with the ability to trespass the intestinal tract, causing systemic infection, have been detected. The aim of the present study was to investigate the presence of CCoV in Greece, to characterize the circulating strains and to investigate the presence of strains detected in the organs. Sampling took place during December of 2007 and December of 2009, collecting faecal and organ samples from dogs presenting acute diarrhoea. Samples were collected from kennels, pet shops and veterinary clinics. RT-PCR and real time (RT-) PCR were used for CCoV detection and characterization. In addition, molecular and phylogenetic analysis took place after sequencing parts of the strains’ genome. CCoV was detected in 65.05% of the animals presenting acute diarrhoea. Moreover, CCoV was detected in 77.34% of the animals living in groups and in 55.13% of the single housed animals, as well as in 73.63% of the dogs, younger than 3 months old and in 58.26% of the elder animals. Both types and subtypes of CCoV were present in Greece, with mixed infections being present in the 47.01% of the CCoV detection. In addition, the variability among strains, as well as the detection of a recombinant, type I-type II strain (THr/85/08) were shown. In three puppies, one CCoVIIa (NA/09) and two CCoVIIb (66/09, 68/09) strains were detected in the organs. The two CCoVIIb strains were isolated in the cell line A72. In the present study, the presence and frequency of CCoV in dogs with acute diarrhoea in Greece were demonstrated, as well as the more frequent detection of CCoV in animals living in groups and in 4 puppies. Moreover, it was shown that mixed CCoV infections prevail, with I/IIa/IIb, detected for the first time. Greek strains manifested significant variability, especially regarding CCoV type I. In addition, the detection of a divergent (ED/99/08/GR) and a recombinant (THr/85/08) strain stands by the theory of intence genetic evolution and variability of coronaviruses. Finally, the three strains detected in the organs, resembling the reference strains, revealed that such strains, of possible high virulence are also present in Greece. Detection of CCoVIIa in the pancreas and the heart, as well as the distribution of CCoVIIb strains in different organs were demonstrated for the first time. The isolation of the two TGEV-like strains of puppies offers the opportunity of further investigation, regarding the pathogenesis of CCoVIIb strains and the protection the commercial vaccine offers.