Equine piroplasmosis in Greece

Abstract

A cross sectional survey was performed to explore the epidemiological status of equine piroplasm infection (EPI) in Greece, with a view to providing a basis for disease control strategies. The investigation, which covered various areas of Greece, focused on: a) the identification of the causative agents of EPI, b) the exploration of the genetic diversity of the identified agents, c) the determination of the risk factors associated with the infection, d) the modeling of the geographic distribution of the disease agents, and e) the detection of areas with significant clusters of infection. A total of 796 equids were used in the study. A total of 787 blood films were examined for evidence of piroplasm stages in stained red blood cells while 544 sera were processed using the competitive inhibition ELISA (cELISA) to detect antibodies to piroplasms. The genetic divergence of piroplasms was explored from 787 DNA samples, using the reverse line blot hybridization (RLB) assay and sequence analysis. The maximum entropy (Maxent) modeling algorithm and the spatial scan statistic were utilized as geospatial tools to derive the potential geographic range and detect clusters of infections, respectively. No piroplasm was detected microscopically. However, the overall seroprevalence of piroplasm infection was 11, 6 %, with 11% for Theileria equi and 2.2% for Babesia. caballi. The emerging profile of equids at risk of significantly high seropositivity level of infection involved mule species, farming activities and residence in the region of Thessaly. A higher seroprevalence was observed in local animals in comparison to imported equids, indicating that the disease is enzootic in Greece. Two Theileria genotypes (T. equi and T. equi-like) and one Babesia genotype (Babesia caballi-like) were distinguished. The prevalence was 43.96 %, 46. 25% and 0.38 % for T. equi, T. equi-like and B. caballi-like respectively. Seven piroplasm-positive samples could not be differentiated neither at species nor at genotype level. A partial sequence of 509 bp of the V4 region of the 18 S rRNA gene of a T. equi-like isolate was obtained and found to be 99 % similar with the reference T. equi-like from Northern Spain from which the detecting probe used in this study was designed, but showed 100 % similarity with the T. equi-like variant from Southern Spain. This indicated some degree of polymorphism within the population of T. equi-like. No unusual parasites previously reported in horses, such as B. canis canis and B. bovis were detected in this study. The values of the bioclimatic variables were very similar between the geographic locations for T. equi and T. equi-like genotypes, suggesting the two are not yet different species as hypothesized by some authors but are possibly undergoing a speciation process within Theileria genotypes. Alternatively, convergence of both genotypes into a single species is possible. The potential geographic range of all the piroplasms covered the entire country but high probability areas for the presence of piroplasm infections concentrated in the Eastern half of mainland Greece. Significant clusters were detected for B. caballi and T. equi infections in North and Central regions of Greece respectively which have significant equine populations. Two competent tick vectors, common transmitters of both T. equi and B. caballi were identified. These consisted of Rhipicephalus bursa and Rhipiecphalus sanguineus collected from horses and dogs respectively at the time of sampling. The present study showed that EPI and their required tick vectors are well established in the country, implying the need for control measures.

Σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν η διενέργεια επιδημιολογικής έρευνας χρονικού σημείου για να μελετηθεί η κατάσταση της πιροπλάσμωσης των ιπποειδών (ΠΙ) στην Ελλάδα, με στόχο τη συλλογή πληροφοριών για τη κατάρτιση στρατηγικών ελέγχου της ασθενείας. Η έρευνα, που κάλυψε διάφορες περιοχές της Ελλάδας, είχε ως σκοπό : α) τον προσδιορισμό των αιτιολογικών παραγόντων της ΠΙ, β) τη διερεύνηση της γενετικής ποικιλομορφίας των πιροπλασμάτων που ανιχνεύθηκαν, γ) το προσδιορισμό των παραγόντων επικινδυνότητας που συνδέονται με τη μόλυνση, δ) τη διαμόρφωση προτυποποίησης της γεωγραφικής κατανομής των πιροπλασμάτων, και ε) την ανίχνευση των περιοχών με σημαντικές εστίες της μόλυνσης. Συνολικά από τα 796 ιπποειδή που περιλήφθηκαν στη μελέτη, 787 δείγματα αίματος εξετάστηκαν με τη μέθοδο της παρατήρησης στο οπτικό μικροσκόπιο μετά από χρώση επιχρίσματος αίματος και 544 δείγματα ορού υποβλήθηκαν σε προσδιορισμό αντισωματών κατά των πιροπλασμάτων χρησιμοποιώντας την ανοσοενζυμική δοκιμασία (cELISA). Η γενετική ποικιλομορφία των πιροπλασμάτων διερευνήθηκε σε 787 δείγματα DNA, χρησιμοποιώντας την αντίστροφη δοκιμή υβριδοποίησης στιγμάτων των γραμμών (RLB) και συμπληρώθηκε με την μελέτη της νουκλεοτιδική τους αλληλουχίας. Η προτυποποίηση της γεωγραφικής κατανομής με χρήση του αλγορίθμου της μέγιστης εντροπίας (Maxent) κ αι η χωρική στατιστική ανίχνευση χρησιμοποιήθηκαν ως γαιοχωρικά εργαλεία για να παραχθεί η πιθανή γεωγραφική κατανομή και να ανιχνευθούν οι εστίες των μολύνσεων, αντίστοιχα. Κανένα παράσιτο δεν ανιχνεύθηκε κατά τη μικροσκοπική παρατήρηση. Εντούτοις, ο συνολικός ορολογικός επιπολασμός της μόλυνσης της ΠΙ ήταν 11, 6% και ειδικότερα 11% για το Τ. equi και 2.2% για το Β. caballi. Ο υψηλότερος επιπολασμός των ιπποειδών βρέθηκε στους ημίονους στη περιοχή της Θεσσαλίας. Επίσης, παρατηρήθηκε στα ζώα της ίδιας περιοχής υψηλότερος επιπολασμός σε σύγκριση με τα εισαγόμενα, δείχνοντας ότι η ασθένεια είναι ενζωοτική στην Ελλάδα. Ανιχνεύθηκαν δύο γενότυποι του είδους Theileria (Τ. equi και Τ. equilike) και ένας γενότυπος του είδους Babesia (Babesia caballi-like). Ο επιπολασμός ήταν 43.96%, 46. 25%, και 0.38% για το Τ. equi, Τ. equi-like, και Β. caballi-like αντίστοιχα. Επτά δείγματα που βρέθηκαν θετικά δεν ήταν δυνατόν να ταυτοποιηθούν σε επίπεδο είδους ή γενοτύπου. Μια μερική αλληλουχία αποτελούμενη από 509 ζεύγη βάσεων της V4 περιοχής του γονιδίου 18S rRNA του Τ. equi-like, απομονώθηκε και βρέθηκε ότι παρουσιάζει ομοιότητα 99% με τοστέλεχος αναφοράς του Τ. equi-like από τη Βόρεια Ισπανία και 100% με στέλεχος αναφοράς Τ. equi-like από τη Νότια Ισπανία. Αυτό έδειξε κάποιο βαθμό πολυμορφισμού μέσα στον πληθυσμό του Τ. equi-like. Κανένα ασυνήθιστο παράσιτο που έχει αναφερθεί σε άλλες μελέτες στα άλογα, όπως το Β. canis canis και το Β. bovis δεν ανιχνεύθηκε στη παρούσα έρευνα. Οι τιμές των βιοκλιματικών μεταβλητών ήταν παρόμοιες μεταξύ των γεωγραφικών θέσεων των γενοτύπων Τ. equi και Τ. equi-like, οπότε δεν πρόκειται για δυο διαφορετικά είδη όπως προτείνουν μερικοί ερευνητές αλλά ενδεχομένως οι γενότυποι να υποβάλλονται σε μια διαδικασία διαφοροποίησης μέσα στο ίδιο είδος του Theileria. Η πιθανή γεωγραφική κατανομή όλων των πιροπλασμάτων κάλυψε ολόκληρη τη χώρα αλλά οι περιοχές με την υψηλότερη πιθανότητα για τη παρουσία των μολύνσεων συγκεντρώθηκαν στο ανατολικό μισό της ηπειρωτικής χώρας. Σημαντικές εστίες των Τ. equi και Β. caballi ανιχνεύθηκαν στις βόρειες και στις κεντρικές περιοχές της Ελλάδας όπου υπάρχει σημαντικός πληθυσμός ιπποειδών. Προσδιορίστηκαν δυο ενδιάμεσοι ξενιστές του Τ. equi και του Β. caballi. Πρόκειται για τους κρότωνες R. sanguineus και R. bursa που συλλέχθηκαν από άλογα και σκύλους αντίστοιχα κατά την διάρκεια της δειγματοληψίας. Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η ΠΙ και οι απαιτούμενοι ενδιάμεσοι ξενιστές (κρότωνες) βρίσκονται στη χώρα, οπότε είναι αναγκαία να ληφθούν μέτρα ελέγχου για την αντιμετώπιση της μόλυνσης στα ιπποειδή.

Une étude cross-sectionelle visant à explorer le statut épidémiologique de la piroplasmose equine (PE) en Grèce a été menée afin de poser les bases pour des futures stratégies de control de la maladie. Les enquêtes couvraient plusieurs zones du pays et se sont focalisées sur les points suivants : a) l’identification des agents pathogènes responsable de la maladie; b) l’exploration de la diversité génétique des agents pathogènes identifiés; c) la détermination des factors de risque associés à l’infection; d) la modélisation de la répartition géographique des agents pathogènes identifiés; e) la détection des zones du domaine d’étude caractérisées par les agrégats d’infections. Au total, 796 équidés étaient impliques dans cette étude. Un total de 787 frottis sanguins en couche mince ont été réalisés et examinés pour la recherche des piroplasmes dans les globules rouges et 544 échantillons de sérum testés par le test diagnostique cELISA (competitive inhibition enzyme-linked immunoabsorbant assay) pour l’évidence d’anticorps dirigés contre les piroplasmes équins. La divergence génétique des piroplasmes a été explorée chez 787 échantillons d’ADN par le biais de la technique RLB (reverse line blot hybridization), accompagnée du séquençage d’ADN. L’algorithme dit d’entropie maximale ainsi que la statistique spatiale de scan ont été respectivement utilisés pour dériver la carte de répartition géographique potentielle et détecter les agrégats spatiaux d’infection à piroplasmes. Aucun piroplasme n’a été détecté par l’examen microscopique des frottis. Cependant, la seroprevalence globale des infections à piroplasmes était de 11.6 %, soit 11 % pour l’infection à Theileria equi et 2.2 % en ce qui concerne Babesia caballi. Le profile des équidés à haut risque de séropositivité pour ces infections qui a émergé était d’être une mule, être impliqué dans les activités agronomiques et être résident de la région de Trikala. Une haute prévalence a été observée chez les animaux locaux en comparaison à ceux qui sont importés, indiquant que la piroplasmose équine est enzootique en Grèce. Deux génotypes du genre Theileria (T. equi et T. equi-like) et un génotype appartenant au genre Babesia (B. caballi-like) ont été distingués. La prévalence se situait respectivement autour de 43.96 %, 46.25 % et 0.38% pour T. equi, T. equilike et B. caballi-like. Sept échantillons ont été testés positive pour les infections à piroplasmes mais ces piroplasmes n’ont pu être différentiés ni à l’échelle de l’espèce, ni à l’échelle du génotype. Une séquence partielle de 509 pb de la région V4 du gène de l’ARNr 18S d’un isolat de T. equi-like obtenu à révélé une similarité de 99 % avec T. equi-like de référence du Nord de l’Espagne à partir duquel la sonde employée dans cette étude a été créée. Cette séquence partielle a aussi montre une similarité de 100 % avec l’autre variant de T. equi-like au sud de l‘Espagne, ce qui indique un certain degré de polymorphisme génétique au sein de la population de T. equilike. Aucun parasite inhabituel précédemment décrit chez les chevaux tel que B. canis canis et B. bovis n’a été détecté dans cette étude. Les valeurs des variables bioclimatiques étaient très similaires entre les locations géographiques des génotypes T. equi et T. equi-like, suggérant que les deux génotypes ne sont pas encore deux espèces différentes d’après l’hypothèse émise par certains auteurs mais seraient plutôt en cours de spéciation. Alternativement, la convergence des deux génotypes en une seule espece est aussi possible. L’aire de distribution potentielle de tous les piroplasms couvrent toute l’étendue de territoire national mais les zones à forte probabilité de présence des infections à piroplasmes sont concentrées dans la moitie Est de la Grèce continentale. Les agrégats spatiaux statistiquement significatifs d’infections à B. caballi et T. equi ont été repérés au Nord et dans les régions du centre de la Grèce, lesquelles contiennent une proportion importante de populations d’équidés. Enfin deux espèces de tiques, à la fois compétent vecteurs de T. equi et B. caballi ont été identifiées. Il s’agit de Rhipicephalus bursa et Rhipicephalus sanguineus, respectivement récoltée sur les chevaux et les chiens. Cette étude à montré que la PE et les tiques vecteurs sont bien établies dans le pays, ce qui invite à la mise en place des mesures adéquates de control.