Στην παρούσα διατριβή περιγράφεται η ανάπτυξη μια βασικής δομής κυτταρικών βιοαισθητήρων, οι οποίοι θα μπορούν να ανιχνεύουν σε ελάχιστο χρόνο και με ικανοποιητική ευαισθησία, αντιγόνα και αντισώματα ιών. Η μεθοδολογική προσέγγιση εστιάζεται στην χρήση γνωστών εργαστηριακών τεχνικών στη βιολογία, βασισμένων στη Βιοηλεκτρική Δοκιμή Αναγνώρισης (Bioelectric Recognition Assay – BERA) για την επίτευξη ενός απλού στη λειτουργία συστήματος ανίχνευσης ιών, σε φυτικούς και ανθρώπινους οργανισμούς.
Επίσης, περιγράφεται η χρήση της τεχνικής της ηλεκτροπόρωσης για την δημιουργία εξειδικευμένων «τροποποιημένων» κυττάρων στην παρουσία συγκεκριμένων ιών. Σαν αντιπροσωπευτικό παράδειγμα χρησιμοποιήθηκαν ινοβλάστες Vero, στην μεμβράνη των οποίων με τη χρήση της εν λόγω τεχνικής, εισήχθησαν αντισώματα των ιών CMV ή TRV ως προς την ανίχνευση των αντίστοιχων ιών που προσβάλουν φυτικούς οργανισμούς και αντισώματα και αντιγόνα του HBV.
Σε σχέση με το πρώτο τμήμα του πειραματικού μέρους, η πρόσδεση του CMV στα κύτταρα του αισθητήρα και, σε δεύτερο πείραμα, του TRV, είχε σαν αποτέλεσμα την πρόκληση συγκεκριμένης και μετρήσιμης μεταβολής στο δυναμικό της μεμβράνης των «τροποποιημένων» κυττάρων του βιοαισθητήρα. Αντίθετα η παρουσία μη ομόλογων ιών όπως του CGMMV και του PVY δεν προκάλεσε καμία μεταβολή στο δυναμικό της μεμβράνης των κυττάρων.
Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και με τη χρήση μικροσκοπίας φθορισμού, όπου η παρουσία ομόλογου ιού ως προς τα αντισώματα που έφεραν τα «τροποποιημένα» κύτταρα, είχε σαν αποτέλεσμα τη μεταβολή της συγκέντρωσης των ιόντων ασβεστίου του κυτταροπλάσματος.
Επιπρόσθετα η εφαρμογή της ανωτέρω μεθόδου σε δείγματα καθαρού ιού σε διαφορετικές συγκεντρώσεις: 0.0 ng ml-1 (control), 5.0, 7.0, 10.0, 13.0 και 20.0 ng ml-1, στην περίπτωση του TRV μας έδωσε ενθαρρυντικά αποτελέσματα ως προς τη δυνατότητα ποσοτικού προσδιορισμού του ιού.
Μελετήθηκε επίσης η επίδραση των TRV και CGMMV στο δυναμικό των ινοβλαστών Vero, καθώς και η πιθανότητα χρήσης μη τροποποιημένων κυττάρων στην ανίχνευση των εν λόγω ιών. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η αντίδραση δεν είναι μεν εξειδικευμένη όμως είναι εμφανής η επίδραση των δύο ιών στο μεμβρανικό δυναμικό.
Η ανάπτυξη ενός βιοαισθητήρα BERA ως εφαρμογή στην ανίχνευση της παρουσίας ηπατικών ιών βασίστηκε στις ίδιες τεχνικές, προσαρμοσμένες στις ιδιαιτερότητες των εν λόγω ιών. Η τροποποίηση των κυττάρων περιελάμβανε την εισαγωγή, με τη χρήση της τεχνικής της ηλεκτροπόρωσης, στην μεμβράνη των κυττάρων Vero του βιοαισθητήρα, αντισωμάτων (anti-HBs, anti-HBe) σαν πρώτη εφαρμογή για την ανίχνευση των αντίστοιχων αντιγόνων του HBV και ως δεύτερη εφαρμογή την εισαγωγή αντιγόνου του ιδίου ιού (HBsAg) για την ανίχνευση του αντίστοιχου αντισώματος.
Η εφαρμογή έλαβε χώρα σε κλινικά δείγματα ορού αίματος ασθενών, ενώ ως ετερόλογος ιός χρησιμοποιήθηκε ο ιός C της ηπατίτιδας (HCV). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε πολύ μικρό χρόνο μόλις 45 δευτερόλεπτα είναι δυνατή η ανίχνευση των μολυσματικών στοιχείων του ιού, αλλά και η εξαγωγή συμπερασμάτων για το στάδιο της μολυσματικότητας που βρίσκεται ο ασθενής.
In the present PhD thesis the development of a cell-biosensor basic
structure is described, which might detect, in minimal time and with
satisfactory sensitivity, antigens and antibodies of viruses. The
methodological approach is focused on the use of established
laboratory techniques in biology, based on Bioelectric Recognition
Assay (BERA), for the development of a simple operating system for
the detection of viruses, in plants and humans.
The use of electroporation is also described, for the preparation of
“membrane-engineered” cells displaying a specific response to certain
viruses. As representative example Vero fibroblasts were used, in the
membrane of which, were inserted antibodies of CMV or TRV. The
attachment of the homologous virus triggered the change of the cell
membrane potential. All cells were immobilized in an alginate matrix.
Regarding the first experimental part, the attachment of CMV on
the cell-biosensor cells, bearing the homologous antibody and
respectively in the studies with TRV, had as result the measurable
change of the “membrane-engineered” cells’ potential. On the contrary
the presence of non-homologous viruses such as CGMMV and PVY did
not trigger any change.
The above results were also confirmed with the use of fluorescence
microscopy, where the presence of a homologous virus caused the
change of Ca2+ concentration in the cytoplasm.
The same process was applied to pure virus solutions in different
dilutions: 0.0 ng ml-1 (control), 5.0, 7.0, 10.0, 13.0 and 20.0 ng ml-1
and in the case of TRV the results were encouraging regarding the
possibility of quantitative determination of the virus.
A short study was carried out as well, in order to evaluate the
reaction of Vero cells, which were not “membrane engineered”, to the
presence of TRV and CGMMV. The reaction was not specific, but it
was obvious that the viruses’ presence triggered changes to the cell
membrane potential. The development of a BERA biosensor as an application for the
detection of hepatitis viruses was based on the same method. Two
applications took place: The first application was related to the
insertion, by electroporosis, of antibodies (anti-HBs, anti-HBe) on the
membrane surface, for the detection of homologous antigens of HBV.
The second application regarded the insertion of the antigen of the
homologous virus (HBsAg) for the detection of the corresponding
homologous antibody (anti-HBs). An alginate matrix was used as well
for the immobilization of the “membrane engineered” cells.
The method was applied on clinical samples; whereas hepatitis C
virus (HCV) was used as the heterologous virus. The results showed
that, in a very short time period (approximately 45 seconds) it is
possible to detect virus elements, as well as to obtain information
regarding the patient’s infectivity stage.
The specificity of BERA biosensors based on “membrane
engineered” cells depends from the specialisation of the antibodies or
antigens, inserted on the surface of the cellular membrane.
Consequently the described methodological approach incorporates
similar disadvantages with the immunological methods. However it
has other advantages such as sensitivity, short time response and
reproducibility. Comparatively with the optical and electrochemical
biosensors, the described in the present study system, has an
additional advantage, which is the one step process.
It should pointed out that the described method is a preliminary
stage for the development of a biosensor system, based on
“membrane-engineered” cells, incorporating a specialisation to the
molecule, chemical compound or micro-organism that is going to be
analyzed.
A short study was carried out also in this case, in order to evaluate
the reaction of Vero cells, which were not “engineered”, to the
presence of HBsAg and HCV. The reaction was not specific, but it was
concluded that the cell membrane potential values were following a
linear pattern, in both cases. We examined the possibility to develop a biosensor for the
detection of plant viruses, which would be more stable. For the
construction of the sensor an automated system was developed and
the biosensor itself was produced it the wells of an ELISA plate.
The method was applied for TRV, CMV and PVY. The samples were
purified virus or infected plant tissues. Three different concentrations
were used 1, 10 and 100ngml-1. The results were very encouraging
and at the first stage it was made possible to detect a virus in single
and in mixed infections and to define the lower detection limit, which
was similar with ELISA method’s respective limit (1ngml-1). It was
shown also the possibility to quantify a virus in a sample.
In order to study the performance of BERA sensors, a comparative
analysis took place and an amperometric sensor was developed,
specialized in the detection of PVY. The amperometric sensor
succeeded in differentiating positive from non-positive samples (nonhomologous
viruses or negative samples), but the detection limit was
higher compared to the respective limit of BERA sensors.
Consequently this sensor is not suitable for screening of plant tissue
samples with low virus concentration, contrary to the BERA sensors
developed in the present thesis.
