Γρίπη ιπποειδών: απομόνωση, μοριακός χαρακτηρισμός και φυλογενετική ανάλυση στελεχών του ιού από τις επιζωοτίες 2003 και 2007 στην Ελλάδα

Abstract

H γρίπη των ιπποειδών είναι μία οξεία, άκρως μεταδοτική λοίμωξη του αναπνευστικού συστήματος των ιπποειδών. Ο αιτιολογικός παράγοντας της νόσου είναι ιός του γένους Influenzavirus A της οικογένειας Orthomyxoviridae. Μέχρι σήμερα είναι γνωστοί δύο υπότυποι της γρίπης των ιπποειδών, ο υπότυπος 1 (Η7Ν7) και ο υπότυπος 2 (Η3Ν8). Ο υπότυπος 1 δεν έχει απομονωθεί από το 1977 σε καμία χώρα, και πιστεύεται ότι έχει αντικατασταθεί από τον υπότυπο 2, ο οποίος έχει προκαλέσει όλες τις επιζωοτίες των τελευταίων δεκαετιών παγκοσμίως. Αποτέλεσμα της έντονης γενετικής ποικιλομορφίας που χαρακτηρίζει τον ιό Η3Ν8 ήταν η εμφάνιση δύο ξεχωριστών εξελικτικών κλάδων, τα στελέχη των οποίων συνεχίζουν να κυκλοφορούν παράλληλα στους πληθυσμούς των ιπποειδών. Οι μεγάλες επιζωοτίες που έχουν καταγραφεί παγκοσμίως μέχρι σήμερα οφείλονται στην υψηλή μεταδοτικότητα της νόσου, ενώ η θνησιμότητα είναι πολύ χαμηλή, εκτός αν υπάρχει δευτερογενής επιπλοκή. Οι καταστροφικές οικονομικές απώλειες που έχουν αναφερθεί λόγω της προσβολής ζώων αναπαραγωγής και αγώνων από τη γρίπη των ιπποειδών, κατέστησαν επιτακτική την ανάγκη εμβολιασμού των ζώων. Παρά τη χρήση εμβολίων όμως, συνέχισαν να καταγράφονται κρούσματα. Συγκεκριμένα, το 2003 καταγράφηκαν μεγάλες επιζωοτίες γρίπης τόσο σε εμβολιασμένους όσο και σε ανεμβολίαστους ίππους, αρχικά στην Ευρώπη και ακολούθως τα επόμενα έτη παγκοσμίως, ακόμα και σε χώρες που δήλωναν απαλλαγμένες της νόσου. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν, η απομόνωση και η μοριακή και φυλογενετική ανάλυση των στελεχών που κυκλοφορούσαν στην Ελλάδα, κατά τη διάρκεια δύο επιζωοτιών του παρελθόντος (2003 και 2007). Για το σκοπό αυτό εξετάστηκαν 30 βαμβακοφόροι στυλεοί ρινικών εκκριμάτων από ανεμβολίαστους ίππους με εμπύρετο γριπώδες σύνδρομο. Η εξέταση των δειγμάτων έγινε αρχικά με τη χρήση ταχείας διαγνωστικής μεθόδου ανοσοπροσδιορισμού (Directigen), για τη διαπίστωση του ιού της γρίπης Α, και στη συνέχεια με RT-PCR που ανιχνελυει μία περιοχή του γονιδίου Μ, η οποία επιβεβαίωσε την παρουσία του εν λόγω ιού. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε απομόνωση του ιού στην ευαίσθητη για το ιό κυτταρική σειρά MDCK. Η ανάπτυξη του ιού στα κύτταρα επιβεβαιώθηκε τόσο με τη δοκιμασία της αιμοσυγκόλλησης, χρησιμοποιώντας ερυθρά αιμοσφαίρια ινδόρνιθας, όσο και με τη χρήση της RT-PCR για το γονίδιο Μ. Η τυποποίηση των στελεχών ως υπότυπος Η3Ν8 πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντιδράσεων RT-PCR ειδικών για τμήματα των γονιδίων Η3 και Ν8. Ειδικά ζεύγη εκκινητών σχεδιάστηκαν για την ανίχνευση τμημάτων των γονιδίων ΝΡ, ΡΑ, ΡΒ1, ΡΒ2 και ΝS του Η3Ν8. Έτσι, με τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικκής αλληλουχίας τμημάτων όλων των γονιδίων έλαβε χώρα η μοριακή και φυλογενετική ανάλυση των στελεχών που απομονώθηκαν, οι οποίες επιβεβαίωσαν ότι τα Ελληνικά στελέχη ήταν ιοί γρίπης ιπποειδών Η3Ν8. Επίσης, διαπιστώθηκε ότι τα Ελληνικά στελέχη προέκυψαν από ανασυνδυασμό γενετικά διαφορετικών στελεχών του ιού Η3Ν8, καθώς ως προς την αιμοσυγκολλητίνη τους προσομοίαζαν με στελέχη που απομονώθηκαν τη δεκαετία του 1990 στην Ευρώπη, ενώ ως προς τα υπόλοιπα γονίδια προσομοίαζαν με πιο πρόσφατα στελέχη που απομονώθηκαν την τελευταία δεκαετία (2000-2010) στην Ευρώπη και στην Ασία. Επομένως, τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν ότι πληροφορίες για την προέλευση ή και την παθογόνο δράση των στελεχών Η3Ν8 μπορούν να δώσουν όχι μόνο ο χαρακτηρισμός του γονιδίου της αιμοσυγκολλητίνης (ΗΑ), στον οποίο περιορίζονταν μέχρι σήμερα οι περισσότερες μελέτες, αλλά και η μοριακή και φυλογενετική ανάλυση και των υπόλοιπων γονιδίων. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης ενισχύουν τη θεωρία ότι κάποια στελέχη που βρίσκονται σε κατάσταση «εξελικτικής στάσης» συνεχίζουν να κυκλοφορούν ανάμεσα στους πληθυσμούς των ιπποειδών. Επομένως η αναδιάταξη τέτοιων στελεχών με άλλα συν-κυκλοφορούντα είναι πολύ πιθανή και ίσως να αποτελεί νέα απειλή για τα ιπποειδή. Το γεγονός ότι στελέχη Η3Ν8 της γρίπης των ιπποειδών έχουν απομονωθεί από χοίρους το 2005 και το 2006, αλλά και σκύλους την περίοδο 2003-2008 υποδηλώνει ότι τα ιπποειδή ίσως να μην αποτελούν πια τον τελικό ξενιστή αυτών των στελεχών. Με την παρούσα έρευνα αναφέρεται για πρώτη φορά η απομόνωση του Η3Ν8 ιού γρίπης των ιπποειδών στην Ελλάδα. H απομόνωση του εν λόγω αναδιαταγμένου στελέχους και η μοριακή και η φυλογενετική ανάλυσή του αποτελούν χρήσιμο εργαλείο τόσο για την προσπάθεια παρακολούθησης των εξελικτικών οδών του ιού της γρίπης των ιπποειδών, όσο και για τον έλεγχο του νοσήματος.

Equine Influenza (EI) is an acute, highly contagious, respiratory disease of equine. The causative agent of EI infections is a type A influenza virus, classified into the family Orthomyxoviridae. Up to today two subtypes of EI are known, subtype 1 (H7N7) and subtype 2 (H3N8). Subtype 1 has not been isolated since 1977, and is presumed that has been replaced by the subtype 2, which is the causative agent of many recent outbreaks. Antigenic drift of H3N8 viruses resulted in the divergence of strains into two distinct evolutionary lineages, which co-circulate. The high morbidity of equine influenza disease was demonstrated in all resent widespread outbreaks all over the world. On the other hand, the mortality rate of influenza disease in equids is generally low, unless secondary bacterial infections occurred. Devastating economic loss of the disease in breeding and race animals reinforced the importance of vaccination. Despite the extensive use of vaccines, outbreaks of equine influenza continue to occur. In 2003 there were widespread outbreaks of equine influenza among un-vaccinates and regularly vaccinated horses in Europe and later all over the world, even regions that rarely report equine influenza outbreaks. The aim of the present study is isolation, molecular and phylogenetic analysis of the Greek strains, from outbreaks in 2003 and 2007. 30 nasal swabs from horses with fever and respiratory signs were used. Swabs were initially tested by a screening rapid test for Influenza A (Directigen) and then by diagnostic RT-PCR for the M gene, and the presence of influenza A virus was demonstrated. Isolation was succeeding in MDCK cell line, which was confirmed by both haemmaglutination with turkey RBCs and RT-PCR. RT-PCR with specific sets of primers for HAH3 and NAN8 was used for the characterization of the strains, as well. Five primer pairs were designed during this study in order to detect NP, PA, PB1, PB2 and NS genes of H3N8 viruses. Molecular analysis confirmed that the Greek isolates were members of H3N8 equine influenza viruses. HA sequences appeared to be more closely related to viruses isolated in Europe in early 1990s, but sequences of the other genes appeared to be more closely related to recent isolates of the last decade in Europe and Asia, suggesting that reassortment had occurred. Although, most studies up to date were limited to the HA characterization, our results suggest that sequencing of other genes, in addition to that encoding HA, is now being increasingly interesting for investigating the origin or pathogenicity of equine influenza viruses. These findings reinforce the “frozen evolution” theory, which describes strains that show reduced amount of antigenic drift compared to the majority of circulating EIVs, and continue to circulate among equines. Thus, reassortment of co-circulation of genetically distinct strains may be threat to equine population. Further evidence that the horse may not be a dead-end host has arisen from the characterisation of two viruses isolated from pigs in 2005 and 2006 and dogs during 2003-2008. For first time we report isolation of H3N8 equine influenza virus in Greece. In addition, isolation, molecular and phylogenetic analysis of the reassorted strain as presented in this study is a useful tool to investigate evolution pathways of H3N8 equine influenza virus in order to control the outbreaks.