Προσδιορισμός μηχανισμού καταστολής φυτοπαθογόνων μυκήτων από το Pseudomonas fluorescens X και ανάπτυξη μολυσμάτων βακτηρίων στο κάλλυμα σπόρων ζαχαρότευτλου

Abstract

Το βακτήριο Pseudomonas fluorescens X είναι ικανός βιολογικός ανταγωνιστής φυτοπαθογόνων µυκήτων και ωοµυκήτων που προκαλούν τήξεις φυταρίων στο σακχαρότευτλο και το αγγούρι. Μετά από µεταλλαξιγένεση µε το µεταθετό στοιχείο Tn5 και εξέταση 12000 µεταλλαγµένων στελεχών, αποµονώθηκαν εννέα µεταλλαγµένα στελέχη τα οποία είχαν χάσει την ικανότητα να παρεµποδίζουν την ανάπτυξη του ωοµύκητα P. ultimum in vitro. O έλεγχος της καταπολέµησης του P. ultimum από τα γονίδια αυτά (φαινότυπος sup) απεδείχθη µε επανόρθωση της µετάλλαξης από τα γονίδια αυτά in trans. Τα γονίδια µε ένθεση του µεταθετού στοιχείου τα οποία είναι υπεύθυνα για την εµφάνιση του φαινοτύπου sup αποµονώθηκαν µε την τεχνική της πλασµιδιακής απελευθέρωσης. Τα γονίδια sup2, sup3 και sup4 κωδικοποιούν πρωτεΐνες (PqqE, PqqD, PqqF) οι οποίες εµπλέκονται στη βιοσύνθεση της πυρρολοκινολινκινόνης (PQQ) και φαίνεται ότι βρίσκονται οργανωµένα σε ένα οπερόνιο. Επιπλέον, βρέθηκε ακόµα ένα γονίδιο (sup1), το οποίο κωδικοποιεί την αφυδρογονάση της γλυκόζης και βρίσκεται σε διαφορετική γονιδιωµατική περιοχή από τα υπόλοιπα. Τέλος, δύο γονίδια (sup5 και sup6, τα οποία κωδικοποιούν αντίστοιχα µια πρωτεΐνη η οποία ανήκει στην οικογένεια των cupin πρωτεϊνών και µια πρωτεΐνη άγνωστης λειτουργίας) φαίνεται ότι βρίσκονται οργανωµένα σε ένα υποθετικό οπερόνιο (supX ). Ανωφερικά του υποθετικού οπερονίου supX , το οποίο περιέχει τρία ακόµα γονίδια (ένα από τα οποία κωδικοποιεί µια NRPS), εντοπίστηκε θέση αναγνώρισης ενός µεταγραφικού παράγοντα της οικογένειας GntR. Μελέτη της συνταινίας του γονιδιακού τόπου του supX αποκάλυψε ότι είναι διαδεδοµένο στο γένος Pseudomonas, αλλά µε σχετικά χαµηλή οµοιότητα µε τα οµόλογά του. Εµφανίζει µεγάλη οµοιότητα µόνο µε το οπερόνιο βιοσύνθεσης της µανγκοτοξίνης από το στέλεχος Ps. syringae pv. syringae UMAF0158. Η έκφραση των γονιδίων του supX µελετήθηκε µε ποσοτική Real-Time PCR. ∆ιαπιστώθηκε ότι η έκφρασή τους επάγεται όταν το βακτήριο βρίσκεται στην ύστερη εκθετική φάση και στη φάση στασιµότητας της ανάπτυξής του παρουσία γλυκόζης στο θρεπτικό µέσο. Η έκφραση των γονιδίων του supX διακόπτεται στα µεταλλαγµένα στελέχη τα οποία έχουν ένθεση του µεταθετού στοιχείου στα γονίδια βιοσύνθεσης του PQQ και στο γονίδιο που κωδικοποιεί την αφυδρογονάση της γλυκόζης. Η αφυδρογονάση της γλυκόζης και η PQQ φαίνεται ότι ρυθµίζουν έµµεσα την έκφραση των γονιδίων του οπερονίου supX , οξειδώνοντας τη γλυκόζη σε γλυκονικό οξύ, το οποίο αποτελεί αναστολέα ορισµένων από τους µεταγραφικούς παράγοντες της οικογένειας GntR. Ο προτεινόµενος µηχανισµός δράσης του βακτηρίου υποδηλώνει την βιοσύνθεση ενός δευτερογενούς µεταβολίτη, πιθανώς κάποιου κυκλικού λιποπεπτιδίου, από το supX και την ρύθµιση της έκφρασης των γονιδίων αυτών από τα επίπεδα του γλυκονικού οξέος. Τόσο ο µηχανισµός αυτός, όσο και τα γονίδια του υποθετικού οπερονίου supX αποτελούν πρώτη επιστηµονική καταγραφή µηχανισµού βιολογικής καταπολέµησης φυτοπαθογόνων µυκήτων από ανταγωνιστές του γένους Pseudomonas.

Pseudomonas fluorescens X has the ability to suppress seed and seedling damping-off in sugar beet and cucumber. Spontaneous mutagenesis and screening a library of 12000 mutants, plasmid rescue, sequencing and complementation analysis showed that biocontrol ability of X is related to genes involved in the biosynthesis of pyrroloquinoline quinone (PQQ), one gene encoding glucose dehydrogenase (gcd), and two more genes (sup5 and sup6), organized in a putative operon (supX ). The supX putative operon consists of five genes in total (one of which encodes a non-ribosomal peptide synthase (NRPS). A unique binding site for a transcriptional factor belonging to the GntR family of transcriptional regulators is localized upstream of supX . Synteny analysis of of the supX putative operon and the GntR binding site revealed that it is found in several bacteria of the genus Pseudomonas, but with a low degree of similarity to most. supX shows high similarity only to the mangotoxin biosynthesis operon in Ps. syringae pv. syringae UMAF0158. Quantitative real-time PCR analysis indicated that transcription of supX is strongly reduced when gcd or one of the genes involved in the biosynthesis of PQQ is mutated. On the contrary, transcription of supX is induced by the presence of glucose in the medium and transcription levels appear to be higher during the late exponential and stationary growth phase in the wild type. Gcd, which uses the PQQ as a cofactor, catalyses the oxidation of glucose to gluconic acid, which has an inhibitory effect for some of the transcriptional factors of the GntR family, thus affecting the transcription of supX . This study provides evidence for a novel mechanism of biological control of P. ultimum by Ps. fluorescens X, controlled by the metabolism of glucose. The biosynthesis of antifungal compound(s) by Ps. fluorescens X is controlled by genes in the supX putative operon. This is the first report on the role of supX in biocontrol of plant pathogens by a strain of Ps. fluorescens.