Παραλαβή, ανάλυση με χρωματογραφικές μεθόδους και αντιμικροβιακή δράση ενώσεων του βακτηρίου Pseudomonas fluorescens X

Abstract

Το βακτήριο Pseudomonas fluorescens X είναι ένας ικανός παράγοντας βιολογικής καταπολέμησης φυτοπαθογόνων μυκήτων οι οποίοι προκαλούν προφυτρωτικές και μεταφυτρωτικές τήξεις σπορίων. Προκειμένου να διερευνηθεί ο μηχανισμός της βιολογικής του δράσης δημιουργήθηκαν μεταλλαγμένα στελέχη του βακτηρίου με τη χρήση του μεταθετού στοιχείου Tn5. Τα στελέχη αυτά δεν παρεμπόδιζαν την ανάπτυξη του μύκητα τόσο in vitro όσο και in vivo. Σε εκχυλίσματα από την καλλιέργεια του Ps. fluorescens Χ και των μεταλλαγμένων στελεχών πραγματοποιήθηκε μελέτη της αντιμικροβιακής τους δράσης. Μείωση της γραμμικής ανάπτυξης του μύκητα Pythium ultimum παρατηρήθηκε μόνο στην περίπτωση του αγρίου τύπου, γεγονός που αποκαλύπτει την παρουσία αντιμικροβιακών ενώσεων οι οποίες εμπλέκονται με την καταστολή του παθογόνου μύκητα. Για την απομόνωση των μεταβολιτών αυτών αναπτύχθηκε ημιπαρασκευαστική μέθοδος υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC). Χρησιμοποιήθηκε επίσης και μέθοδος χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας (TLC), σε συνδυασμό με εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE). Aκολούθησε μελέτη της βιοδραστικής τους ικανότητας in vitro. Ορισμένοι από τους ύποπτους μεταβολίτες εμφάνισαν παρεμπόδιση της γραμμικής ανάπτυξης του μύκητα κατά τη βιοδοκιμή. Μια πρώτη προσπάθεια ταυτοποίησης των αναλυτών αυτών έγινε με υγρή χρωματογραφία φασματομετρία μαζών με την τεχνική (APCI-MSD), όπου φαίνεται πιθανό οι αντιμικροβιακές ενώσεις να ανήκουν στην κατηγορία των αντιβιοτικών, λόγω του μικρού τους μοριακού βάρους. Ο χαρακτηρισμός της δομής των αντιμικροβιακών ενώσεων έγινε με συνδυασμό των τεχνικών της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης συνδυασμένης με φασματοσκοπία υπεριώδους ορατού και φασματομετρία μαζών (HPLC-UV-Vis-MS), με υπέρυθρη φασματοσκοπία με μετασχηματισμό Fourrier (FT-IR), με αέρια χρωματογραφία σε συνδυασμό με φασματομετρία μαζών (GC-MS) και με πυρηνικό μαγνητικό συντονισμό (NMR). Τα αποτελέσματα της έρευνας έδειξαν ότι οι ουσίες με αντιμικροβιακή δράση που απομονώθηκαν από την καλλιέργεια του βακτηρίου Pseudomonas fluorescens X είναι νέες ενώσεις που δεν αντιστοιχούν σε κάποια από τις ήδη γνωστές και ταυτοποιημένες ενώσεις της βιβλιογραφίας. Μία επίσης από τις αντιμικροβιακές ουσίες που χαρακτηρίστηκαν βρέθηκε να ανήκει στην ομάδα των τοξινών.

Pseudomonas fluorescens strain X is an efficient biological antagonist of soil borne phytopathogenic fungi that cause damping-off of seeds and seedlings. In order to investigate the mechanism of its biological activity, mutants deficient in the antifungal activity in vitro and in vivo were generated by mutagenesis using the transposon Tn5. Fungitoxicity tests of bacterial extracts from solid cultures of the wild type and mutant strains showed significant reduction of mycelial growth of Pythium ultimum only in the case of the wild type. These results indicate that the possible mechanism of biological activity of Ps. fluorescens Χ is due to the production of antimicrobial metabolites. Two methods for the isolation of the antimicrobials were developed: a method using semi-preparative high performance liquid chromatography (HPLC) and a method of thin layer chromatography (TLC), in combination with solid phase exctraction (SPE). In vitro bioassays were subsequently performed to test the isolated compounds for antifungal activity. Direct application of each of these purified metabolites with Pythium ultimum resulted in growth suppression of fungi. Structure elucidation using atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometric detector (APCI-MSD) suggested that they are probably antibiotics due to their low molecular weight. Chemical structure was also analyzed by LC-MS/MS analysis, GC-MS analysis, Fourier Transform-IR analysis and Nuclear Magnetic Resonance. The results of this research revealed that all of the antimicrobial compounds produced by the Pseudomonas fluorescens strain X, are new compounds. One of the compounds also who was further characterized it was found to belong to the group of the toxins.