Βιοποικιλότητα και ποσοτική εκτίμηση του πληθυσμού του Listeria monocytogenes σε νωπό κρέας και προϊόντα του

Abstract

Ο μικροοργανισμός Listeria monocytogenes είναι το παθογόνο αίτιο της λιστερίωσης. Μολονότι η συχνότητα εμφάνισης της νόσου στον άνθρωπο είναι σχετικά μικρή, τα κρούσματα λιστεριώσεων χαρακτηρίζονται από υψηλή θνητότητα (20-30%), ιδιαιτέρως μεταξύ ατόμων που ανήκουν σε ευαίσθητες ομάδες του πληθυσμού, όπως τα νεογνά, οι ηλικιωμένοι, οι έγκυες και οι ανοσοκατεσταλμένοι. Τις τρεις τελευταίες δεκαετίες τα καταγεγραμμένα κρούσματα λιστεριώσεων έχουν αυξηθεί σημαντικά, εξαιτίας ομαδικών προσβολών από L. monocytogenes τροφιμογενούς προέλευσης. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ποσοτικοποίηση της παρουσίας και η μελέτη της βιοποικιλότητας του παθογόνου μικροοργανισμού L. monocytogenes σε νωπό κρέας και προϊόντα του. Για την επίτευξη αυτού του σκοπού τέθηκαν ως κύριοι στόχοι μελέτης οι εξής: α) η διεξαγωγή έρευνας πεδίου για τη μελέτη της μικροχλωρίδας και για την εκτίμηση της μικροβιολογικής ποιότητας και υγιεινής νωπού χοίρειου κιμά, β) ο υπολογισμός του επιπολασμού του μικροοργανισμού L. monocytogenes σε νωπό χοίρειο κιμά, καθώς και ο προσδιορισμός των παραμέτρων-χαρακτηριστικών επίδοσης τριών μικροβιολογικών θρεπτικών υποστρωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση του παθογόνου στον κιμά, γ) ο προσδιορισμός του διαστήματος εμπιστοσύνης και της αβεβαιότητας καθεμίας των παραμέτρων επίδοσης των χρησιμοποιούμενων υποστρωμάτων, με εφαρμογή της μπαγεσιανής προσεγγιστικής μεθόδου, δ) η πρόβλεψη του επιπολασμού και της συγκέντρωσης του βακτηρίου L. monocytogenes σε νωπό χοίρειο κιμά, με χρήση της μπαγεσιανής προσεγγιστικής μεθόδου και ε) η μελέτη της βιοποικιλότητας του L. monocytogenes σε νωπό χοίρειο κιμά με τη βοήθεια μοριακών μεθόδων αποτύπωσης του γονιδιώματος του μικροοργανισμού, όπως είναι η πολλαπλή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (mPCR), η τυχαία ενίσχυση του πολυμορφικού DNA (RAPD) και η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης επαναλαμβανόμενων στοιχείων (rep-PCR). Οι πληθυσμοί των μικροοργανισμών, πλην του L. monocytogenes, οι οποίοι προσδιορίστηκαν κατά τη διεξαγωγή της προαναφερόμενης έρευνας πεδίου, επεξεργάστηκαν μέσω της πολυμεταβλητής στατιστικής ανάλυσης. Από τις κατανομές των μικροβιακών πληθυσμών στα δείγματα του νωπού χοίρειου κιμά που αναλύθηκαν, διαπιστώθηκε η επικράτηση των ψευδομονάδων έναντι όλων των υπολοίπων ομάδων μικροοργανισμών. Με τη βοήθεια εργαλείων της πολυμεταβλητής ανάλυσης οι μικροβιακοί πληθυσμοί αναδιατάχθηκαν σε κύριες συνιστώσες σχετιζόμενες με τη μικροβιολογική ποιότητα και υγιεινή του κρέατος. Όσον αφορά στον μικροοργανισμό L. monocytogenes, για τον ακριβή υπολογισμό του επιπολασμού του στο νωπό χοίρειο κιμά έγινε παράλληλη χρήση των μικροβιολογικών υποστρώματων PALCAM, ALOA και RAPID’L.mono. Κατόπιν αυτού, ο επιπολασμός του παθογόνου στον κιμά υπολογίστηκε στο 22%. Εξάλλου, η παράλληλη χρήση δύο τουλάχιστον χρωμογόνων θρεπτικών υποστρωμάτων, όπως είναι τα ALOA και RAPID’L.mono, σε συνδυασμό με την εφαρμογή της μπαγεσιανής προσεγγιστικής μεθόδου κατέστησε δυνατή την πρόβλεψη του επιπολασμού του L. monocytogenes στο νωπό χοίρειο κιμά. Μέσω της μπαγεσιανής ανάλυσης είναι δυνατός ο καλύτερος χειρισμός της αβεβαιότητας και για άλλες παραμέτρους, εκτός του επιπολασμού του μικροοργανισμού, όπως είναι η ευαισθησία και η ικανότητα εξειδίκευσης των χρησιμοποιούμενων θρεπτικών υποστρωμάτων. Ταυτόχρονα, με χρήση των αποτελεσμάτων παρουσίας και απουσίας του μικροοργανισμού εκτιμήθηκε η συγκέντρωση του L. monocytogenes στον κιμά σε 14 και 17 cfu/kg προϊόντος με βάση τα υποστρώματα ALOA και RAPID’L.mono αντίστοιχα. Η μελέτη της βιοποικιλότητας του L. monocytogenes σε νωπό χοίρειο κιμά με τη βοήθεια της mPCR αποκάλυψε την παρουσία των ορότυπων 1/2a (77%), 1/2b (5%), 1/2c (1%), 4b (5%) και 4ab (10%), ενώ η ορολογική τυποποίηση ορισμένων στελεχών (2%) δεν ήταν δυνατή. Οι RAPD και rep-PCR διαχώρισαν και ομαδοποίησαν ικανοποιητικά το σύνολο των στελεχών του μικροοργανισμού που απομονώθηκαν από τον κιμά, συνεισφέροντας με αυτόν τον τρόπο στη διερεύνηση της γενετικής παραλλακτικότητας του L. monocytogenes. Σε ορισμένες περιπτώσεις ωστόσο, η γενετική ομοιότητα των στελεχών δεν σχετιζόταν με την προέλευσή τους.

Listeria monocytogenes is the causative agent of listeriosis. Despite the low incidence of the disease in humans, listeriosis is characterized by high hospitalization and case fatality rates (i.e. 20-30%), especially among individuals belonging in the YOPI segment, i.e. young, old, pregnant, and immune-compromised people. During the past three decades, the recorded cases of L. monocytogenes infections have been grown significantly due to several outbreaks of foodborne-related listeriosis. The aim of this thesis was to quantify L. monocytogenes presence and study pathogen’s biodiversity in fresh meat and products thereof. The following main objectives were set: a) screening for microbial populations in naturally contaminated fresh minced pork meat and thus evaluating its microbiological quality and hygiene by conducting a field survey, b) estimation of prevalence for L. monocytogenes in fresh minced pork meat and determination of the performance attributes (e.g. sensitivity, specificity) of three culture media used for the detection of pathogen in mince, c) estimating the confidence intervals and uncertainties (i.e. diagnostic accuracy) for the performance attributes of each medium used for the L. monocytogenes detection, from a Bayesian perspective, d) quantifying L. monocytogenes prevalence and concentration in fresh minced pork meat from presence/absence microbiological testing, through Bayesian inference, and e) studying the biodiversity of L. monocytogenes in naturally contaminated fresh minced pork meat by applying molecular DNA-based typing methods (i.e. multiplex PCR, RAPD, rep-PCR). The microbial association of naturally contaminated fresh minced pork meat and its hygienic condition were established, while data for the populations of microorganisms detected were subjected to multivariate statistical analysis. All the microbiological parameters examined during the field survey, except L. monocytogenes, were reconstructed to principal components related to shelf life and meat hygiene using tools provided by multivariate analysis. The distribution of populations in mince demonstrates a classic synthesis of a microbial association, with dominance of pseudomonads. As far as L. monocytogenes is concerned, prevalence of the pathogen in minced pork meat was calculated at 22% by simultaneous (i.e. parallel) use of the PALCAM, ALOA and RAPID’L.mono selective media. None of the aforementioned media was efficient in detecting the true prevalence of L. monocytogenes in mince alone. However, the parallel use of at least two chromogenic media, such as ALOA and RAPID’L.mono, together with the application of a Bayesian modeling approach enabled the prediction of pathogen’s prevalence in fresh minced pork meat with high accuracy, without the need for further confirmation of typical L. monocytogenes colonies isolated from Petri dishes. Better handling of the uncertainty associated with other attributes of interest apart from prevalence, such as sensitivity and specificity of culture media, could be achieved through the Bayesian analysis, as well as an estimation of L. monocytogenes concentration in mince could be obtained from microbiological presence/absence testing. As a result, L. monocytogenes concentration in minced pork meat was estimated at 14 and 17 cfu/kg of mince based on ALOA and RAPID’L.mono agars, respectively. Finally, studying biodiversity of L. monocytogenes in fresh minced pork meat through serotyping of identified isolates of the pathogen by multiplex PCR revealed the presence of serovars 1/2a (77%), 1/2b (5%), 1/2c (1%), 4b (5%) and 4ab (10%), whereas serotyping of some isolates (2%) was not feasible. RAPD and rep-PCR resulted in reproducible distinct electrophoretic DNA patterns, managing in that way to differentiate and group L. monocytogenes mince isolates into clusters with possible references to strain variability. Nevertheless, the recovery of strains sharing identical typing results indicated that similar strains were not associated with the same minced meat samples and isolation media.