Ανάπτυξη της τεχνολογίας μεμβρανικής μηχανικής στους κυτταρικούς βιοαισθητήρες για τον προσδιορισμό του σουπεροξειδίου και εφαρμογή της στη μελέτη φαινομένων κυτταρικής διαίρεσης και διαφοροποίησης

Abstract

Η μεμβρανική μηχανική είναι μια γενική, καινοτόμος μεθοδολογία για την αύξηση της ευαισθησίας των κυτταρικών βιοαισθητήρων έναντι των μορίων-στόχων, ηλεκτροεισάγοντας τον ειδικό υποδοχέα στην κυτταρική επιφάνεια. Σημείο εκκίνησης της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ανάπτυξη, σε προηγούμενη μελέτη, ενός ευαίσθητου αισθητήρα για την ανίχνευση σουπεροξειδίου (O2-) βασισμένου σε ακινητοποιημένα κύτταρα, τα οποία τροποποιήθηκαν μεμβρανικά με το ένζυμο δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD). Στην παρούσα μελέτη, τεκμηριώνεται ότι η αντίδραση του O2- με την SOD προκαλεί αλλαγές στο μεμβρανικό δυναμικό των μεμβρανικώς τροποποιημένων κυττάρων Vero, όπως επιβεβαιώνεται από τις ηλεκτροφυσιολογικές και φθορισμομετρικές μετρήσεις. Αυτές οι αλλαγές συσχετίστηκαν με αλλαγές της συγκέντρωσης του ενδοκυτταρικού ασβεστίου, όπως φαίνεται μετά την εκλεκτική παρεμπόδιση του ενδοκυτταρικού μονοπατιού ασβεστίου. Επιπλέον, εφαρμόζοντας εκλεκτικούς παρεμποδιστές, αποδεικνύεται ότι τα ηλεκτροεισαχθέντα μόρια της SOD διατηρούν τις καταλυτικές τους ιδιότητες. Ερευνήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης της ηλεκτροεισαχθείσας SOD. Τέλος, αυξήθηκε η ευαισθησία του αισθητήρα κατά 100 φορές, με όριο ανίχνευσης 1 pM O2-, σαν συνέπεια της μεταβολής της συγκέντρωσης των ακινητοποιημένων κυττάρων στον αισθητήρα. Μελετήθηκε η πιθανή σχέση ανάμεσα στα επίπεδα των ελευθέρων ριζών (ROS) και της κυτταρικής διαίρεσης κατά την in vitro επταήμερη καλλιέργεια του υδρόβιου φυτού Spirodela polyrrhiza. Πιο συγκεκριμένα, καταγράφτηκε η συγκέντρωση του σουπεροξειδίου χρησιμοποιώντας τον εξελιγμένο βιοαισθητήρα. Μια σημαντική μείωση των ROS αλλά και της συγκέντρωσης του O2-, παρατηρήθηκε κατά τις δύο πρώτες ημέρες της καλλιέργειας, ενώ η S. polyrrhiza βρίσκονταν κοντά στην εκθετική φάση ανάπτυξης. Επιπλέον, αποπτωτικοί δείκτες όπως είναι η συγκέντρωση του κυτοπλασματικού κυτοχρώματος C, η αποπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης και η δραστικότητα της κασπάσης-3 φθίνουν κατά τη περίοδο καλλιέργειας τουλάχιστον πριν την ωρίμανση των φυλλιδίων. Θεωρείται ότι η διαίρεση των φυλλιδίων του S. polyrrhiza μπορεί να δραστηριοποιήθηκε από παρατηρούμενη μείωση των ελευθέρων ριζικών και τη σχετική αποφυγή των κυτταρικών αποπτωτικών μονοπατιών των καλλιεργούμενων φυτών. Επίσης οι ROS έχει φανεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στην κυτταρική διαφοροποίηση. Στην παρούσα μελέτη, τα κύτταρα νευροβλαστώματος διαφοροποιήθηκαν με φορσκολίνη και κυκλική μονοφωσφορική διβουτυρυλαδενοσίνη (db-cAMP) . Η διαφοροποίηση εκφράστηκε σαν ανάπτυξη των νευριτών χρησιμοποιώντας τη χρωστική coomassie brilliant blue μετά από 48 ώρες επώασης των ουσιών διαφοροποίησης. Η διαφοροποίηση συνοδεύτηκε με αύξηση των ROS και του μιτοχονδριακού O2-, και τα δύο ανιχνεύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Παράλληλα έγινε καταγραφή της συγκέντρωσης O2- με τον βιοαισθητήρα για την αξιολόγηση του συγκρίνοντάς τον με μια κλασική μέθοδο όπως είναι η κυτταρομετία ροής. Όπως παρατηρήθηκε, υπήρξε μεγάλη συσχέτιση των αποτελεσμάτων. Επιπροσθέτως, ο βιοαισθητήρας δοκιμάστηκε στην κλινική ιατρική, με σκοπό την καταγραφή των επιπέδων O2- σε ασθενείς σε μεταγχειριτική κατάσταση. Έχει συχνά προταθεί ότι το οξειδωτικό στρες είναι πιθανός εμπλεκόμενος παράγοντας του μετεγχειριτικού στρες. Τα αποτελέσματα, αν και πρώϊμα, λόγω του μικρού ακόμα μεγέθους δείγματος, κατέδειξαν ότι τα επίπεδα του Ο2- ήταν πιο αυξημένα στους ασθενείς με δυσμενή μετεγχειρητική εξέλιξη. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα των ανεξαρτήτων επιμέρους πειραματικών ενοτήτων της παρούσας διατριβής (1) αποσαφήνισαν τις βαθύτερες πτυχές του μηχανισμού λειτουργίας της μοριακής αναγνώρισης μέσω μεμβρανικής μηχανικής και (2) επιβεβαίωσαν την αποτελεσματικότητα και τις σημαντικές προοπτικές εφαρμογής του βιοαισθητήρα σουπεροξειδίου που αναπτύχθηκε με βάση τη συγκεκριμένη τεχνολογία.

Membrane-engineering is a generic novel methodology for increasing the selectivity of a cell biosensor against a target molecule, by electroinserting target-specific receptor molecules on the cell surface. The starting point of the present dissertation is the previously reported construction of an ultra-sensitive superoxide anion (O2-) sensor based on immobilized cells, which have been membrane-engineered with superoxide dismutase (SOD). In the present study, evidence is provided that superoxide dismutation triggered changes to the membrane potential of membrane- engineered fibroblast cells, as confirmed by electrophysiological and fluorescence assays. These changes were associated with changes in [Ca2+]cyt, as revealed by the selective inhibition of intracellular calcium ion traffic. In addition, by conducting selective inhibition assays, it is demonstrated that electroinserted SOD molecules retained their characteristic catalytic properties. The effect of the concentration of electroinserted SOD molecules on the performance of the superoxide assay was also investigated. Finally, the sensitivity of the sensor was increased by hundredfold to a detection limit of 1 pM O2- by changing the concentration of immobilized cells on the performance of the biosensor. The next step was the investigation of a possible relationship between the levels of reactive oxygen species (ROS) and the stimulation of frond division of the aquatic plant Spirodela polyrrhiza (duckweed) during a 7-day experimental culture period. In particular, superoxide concentration was monitored using a state-of-the-art cell biosensor. A considerable reduction in ROS and superoxide concentration was observed during the first two days of culture, whereas duckweed cultures achieved near exponential growth rates after the second day. In addition, apoptotic markers such as the cytoplasmic concentration of cytochrome C, mitochondrial membrane depolarization and the activity of caspase-3 declined during the culture period and at least before daughter frond maturation. It is suggested that S. polyrrhiza frond division may have been stimulated by the observed reduction of free radicals and the associated avoidance of cell apoptotic pathways in cultured plants. Also ROS have been shown to have an important role in cell differentiation. In the present study, N2a murine neuroblastoma cells were differentiated by treatments with forskolin or dibutyryl cyclic AMP. The differentiation was expressed as the development of neurites, observed using coomassie brilliant blue after 48h treatment. This was accompanied by an increase in the concentration of ROS and specifically mitochondrial superoxide, both detected by flow cytometry. At the same time the superoxide concentration was monitored using the novel biosensor, whereas a high correlation between the two different methods of superoxide detection (flow cytometry-biosensor) was observed. In an additional approach, the biosensor was applied to yet another complex biological system, i.e. in clinical medicine as a diagnostic method to patients in order to detect their post-operative status. It has been frequently suggested that oxidative stress is involved in post-operative stress. The results, though preliminary, due the small patient sample size, showed that the levels of O2- in patients with worst recovery rate were highest. In conclusion, the results of the individual partial experimental sections of the present study (1) elucidated the deepest aspects of the working principle of the molecular identification through membrane engineering and (2) confirmed the efficiency and considerable application perspectives of the superoxide biosensor based on this technology.