Οι μεταφοράσες της γλουταθειόνης (glutathione S-transferases, GSTs, EC 2.5.1.8),
είναι πολυλειτουργικά ένζυμα, που καταλύουν την πυρηνόφιλη προσβολή της
σουλφυδρυλικής ομάδας του τριπεπτιδίου της γλουταθειόνης (GSH) στο
ηλεκτρονιόφιλο κέντρο ενδογενών και ξενοβιοτικών ενώσεων (π.χ. φαρμάκων,
φυτοπροστατευτικών προϊόντων), σχηματίζοντας υδατοδιαλυτά σύμπλοκα. Τα
σύμπλοκα αυτά, απεκκρίνονται εύκολα από το κύτταρο. Οι GSTs απαντούν στα
θηλαστικά, στα φυτά, στα έντομα, στους μύκητες και στα βακτήρια. Παρουσιάζουν
ακόμα δράση υπεροξειδάσης, ισομεράσης, διϋδροασκορβικής ρεδουκτάσης. Τέλος,
λειτουργούν και ως μεταφορείς υδρόφοβων μορίων για τη μεταφορά και αποθήκευση
τους, μέσα στο κύτταρο.
Η δομική τους ευελιξία είναι αυτή που επιτρέπει και τη
διαφοροποίηση της καταλυτικής τους δράσης.
Συνολικά ο σκοπός της παρούσας διατριβής, ήταν η εύρεση ενζύμων GSTs που θα
μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν, για την ανάπτυξη απλών αναλυτικών μεθόδων με
δυνατότητα κατασκευής βιοαισθητήρα, για τον προσδιορισμό φυτοπροστατευτικών
προϊόντων σε δείγματα κυρίως περιβαλλοντικά, αλλά και βιολογικά. Η αναγκαιότητα
τέτοιου είδους ερευνών είναι αδιαμφισβήτητη, λόγω της αλόγιστης χρήσης
φυτοπροστατευτικών προϊόντων, της υπολειμματικότητας που εμφανίζουν και της
τοξικότητας τους στα οικοσυστήματα. Η έρευνα αυτή χωρίστηκε σε τρείς επιμέρους,
όπου στη πρώτη (Κεφάλαιο 3), μελετήθηκαν GSTs από τον άνθρωπο, ενώ οι άλλες
δύο (Κεφάλαιο 4 και 5) αφορούσαν σε φυτικές GSTs.
Στην πρώτη μελέτη, μελετήθηκαν ισοένζυμα από τον άνθρωπο, ως προς τα
φυτοπροστατευτικά προϊόντα. Αφού λοιπόν πρώτα εκφράστηκαν τα ισοένζυμα
hGSTP1*A, hGSTP1*B, hGSTP1*C, hGSTA1-1, hGSTT2-2 και hGSTO1-1,
καθαρίστηκαν με χρωματογραφία συγγένειας, ακολούθησε σάρωση ως προς μεγάλη ποικιλία ζιζανιοκτόνων και εντομοκτόνων. Από τις μετρήσεις προέκυψε ότι, το
hGSTA1-1 φαίνεται να αναστέλλεται περισσότερο, παρουσιάζοντας τη μεγαλύτερη
αναστολή της δραστικότητας (>95%) με τα εντομοκτόνα dieldr in και spir o mes ifen,
ενώ οι μικρότερες τιμές IC50 παρατηρήθηκαν στους 37
0
C και σε pH 6,5, οι οποίες
ήταν 17,9 ± 1,7 μΜ και 12,1 ± 3,4 μΜ αντίστοιχα. Οι ενώσεις αυτές αλληλεπιδρούν
με το ένζυμο, στην περιοχή δέσμευσης των υποστρωμάτων (G- και H-περιοχή) του
ενεργού κέντρου και συμπεριφέρονται σαν αναστολείς μικτού-τύπου (K
2,3±0.1 και
0,1±0,01 μΜ, έναντι GSH και CDNB, αντίστοιχα). Οι πρότυπες καμπύλες οι οποίες
σχεδιάστηκαν (σταθερή απόκλιση 4,1%), με γνωστές συγκεντρώσεις των δύο
εντομοκτόνων, επιτρέπουν τον ακριβή ποσοτικό προσδιορισμό τους σε δείγματα
νερού, με αποτελέσματα συγκρίσιμα της HPLC μεθόδου. Από την παρούσα μελέτη
φαίνεται ότι το ισοένζυμο hGSTA1-1, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη
νέων απλών μεθόδων αναλυτικού προσδιορισμού φυτοπροστατευτικών με
ικανοποιητική ακρίβεια, συνδυάζοντας χαμηλό κόστος και ελάχιστη προετοιμασία
δείγματος.
Οι μεταφοράσες της γλουταθειόνης (GSTs) που απαντούν στα φυτά, αποτελούν μια
μεγάλη οικογένεια από ισοένζυμα, τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στην
αντιμετώπιση συνθηκών καταπόνησης και στην αποτοξίνωση ξενοβιοτικών. Τέσσερα
GST ισοένζυμα από φύλλα του φυτού P.vulgaris, αλληλουχήθηκαν και η ανάλυση
των cDNA έδειξε υψηλή ομολογία με GSTs των τάξεων τ (tau) και φ (phi). Στη
συνέχεια εκφράστηκαν σε E. coli και καθαρίστηκαν με χρωματογραφία συγγένειας.
Ακολούθησε προσδιορισμός της ειδικής δραστικότητας των ισοενζύμων έναντι 20
διαφορετικών υποστρωμάτων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα ισοένζυμα GSTs
καταλύουν μεγάλο εύρος αντιδράσεων και επιδεικνύουν ευρεία εκλεκτικότητα.
Πραγματοποιήθηκε μοριακή μοντελοποίηση και ανάλυση της δομής, ώστε να
αναγνωριστούν τα δομικά χαρακτηριστικά, να κατανοηθεί η εξειδίκευση
υποστρώματος και ο καταλυτικός μηχανισμός αυτών των ενζύμων. Τα αποτελέσματα
αυτά έδωσαν νέα στοιχεία σχετικά με την καταλυτική και δομική ετερογένεια των
GSTs του P. vulgaris.
Η μελέτη δραστικότητας φανέρωσε την ποικιλομορφία που χαρακτηρίζει αυτά τα
ισοένζυμα, ως προς την εξειδίκευσή τους. Για το κάθε ισοένζυμο υπήρξε διαφορετικό
καλύτερο υπόστρωμα, με τα ισοένζυμα PvGSTU1-1, PvGSTU2-2, PvGSTU3-3 και
PvGSTF1-1, να παρουσιάζουν μεγαλύτερη δραστικότητα, ως προς τα υποστρώματα ισοθειοκυανικό αλλυλ-εστέρα, 4-χλωρο-7-νιτροβενζο-2-οξο-1,3-διαζόλιο , 1-χλώρο2,4-δινιτροβενζόλιο
και
2,2
διθειοδιαιθανόλη,
αντίστοιχα.
Δομικές αναλύσεις έδειξαν ότι οι PvGSTs μοιράζονται ίδια χαρακτηριστικά με άλλες
κυτταροπλασματικές φυτικές GSTs, με διαφορές στο ενεργό τους κέντρο και στη Cτελική
περιοχή, καθώς και στον σύνδεσμο των N- και C- τελικών περιοχών. Η
ετερογένεια που παρατηρήθηκε στη C-τελική περιοχή, φαίνεται να είναι υπεύθυνη
για την διαφορετική εξειδίκευση στις PvGSTs.
Τα παραπάνω ισοένζυμα όμως που μελετήθηκαν, δεν έδειξαν ικανοποιητική
ευαισθησία αναστολής, ως προς φυτοπροστατευτικά προϊόντα. Έτσι, έχοντας ως
σκοπό την ανάπτυξη βιοαισθητήρα ανίχνευσης και προσδιορισμού
φυτοπροστατευτικών προϊόντων, αποφασίστηκε η εφαρμογή μεθόδων πρωτεϊνικής
μηχανικής, ώστε να διευρυνθεί η δυνατότητα ευρέσεως νέων ενζύμων GSTs, με
ικανοποιητική ευαισθησία ως προς τα φυτοπροστατευτικά προϊόντα.
Για το σκοπό αυτό καταπονήθηκαν φυτά P.vulgaris και G.max, θέλοντας να επαχθεί
η έκφραση των GSTs, απομονώθηκε RNA με σκοπό τη δημιουργία cDNA
βιβλιοθήκης. Χρησιμοποιώντας κατάλληλους εκφυλισμένους εκκινητές και PCR,
απομονώθηκαν GST γονίδια από φύλα, βλαστό και ρίζα. Τα GST γονίδια
υποβλήθηκαν σε in vitro κατευθυνόμενη εξέλιξη (DNA shuffling). H βιβλιοθήκη
νέων GST γονιδίων που προέκυψε, κλωνοποιήθηκε σε φορέα κατάλληλο για
έκφραση σε E. coli. Σάρωση της βιβλιοθήκης, οδήγησε στην επιλογή μιας νέας
μορφής GST ενζύμου, που ανήκει στην τ τάξη. Το νέο αυτό ένζυμο (PvGmGSTUG)
καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας και μελετήθηκε κινητικά. Επίσης
ελέγχθηκε η εκλεκτικότητά του, ως προς 20 υποστρώματα και 66 φυτοπροστατευτικά
προϊόντα. Το ένζυμο αυτό εμφανίζει υψηλή δράση μεταφοράσης και υπεροξειδάσης
της γλουταθειόνης.
Μελετώντας τα διαφορετικά φυτοπροστατευτικά προϊόντα, βρέθηκαν κυρίως τα
οργανοχλωριωμένα εντομοκτόνα και οι στρομπιλουρίνες (μυκητοκτόνα), να είναι
ισχυροί αναστολείς του ενζύμου. Η ευαισθησία του ενζύμου ως προς τα
φυτοπροστατευτικά βελτιώθηκε περαιτέρω, εφαρμόζοντας κατευθυνόμενη
μεταλλαξογένεση κορεσμού στη θέση Phe117 της αμινοξικής αλληλουχίας. Τελικά
προέκυψαν επτά νέες μεταλλαγμένες μορφές, οι οποίες σε γενικές γραμμές
διατήρησαν παρόμοια κινητική συμπεριφορά με αυτόν του ενζύμου PvGmGSTUG, παρουσιάζοντας όμως βελτίωση ως προς τη συγγένεια του με τη GSH. Η μορφή
Phe117Ile εμφάνισε 5-φορές υψηλότερη καταλυτική αποτελεσματικότητα και
μεγαλύτερη ευαισθησία έναντι της ομάδας των οργανοχλωριωμένων εντομοκτόνων.
Συνεπώς, η μορφή Phe117Ile χρησιμοποιήθηκε για την μελέτη κατασκευής οπτικού
βιοαισθητήρα.
Το ένζυμο ακινητοποιήθηκε σε σύστημα sol-gel αλκοξυσιλανίων (TEOS/PTMOS), το
ίδιο και οι δείκτες pH bromocresol purple (όξινος) και phenol red (βασικός). Έτσι με
σύστημα δύο διαφορετικών εγκλωβισμών, αναπτύχθηκε αναλυτική μέθοδος
προσδιορισμού του ισομερούς α-endosulfan. To σύστημα εμφανίζει γραμμικότητα
στην περιοχή pH=4-7 στα 562 nm. Πρότυπη καμπύλη για το α-endosulfan
σχεδιάστηκε σε εύρος συγκέντρωσης 0-30 μM.
Glutathione S-transferases (GSTs, EC 2.5.1.8), are mult ifunctional enzymes that
catalyze the nucleophilic addition of the sulfur atom of glutathione to the electrophilic
groups of a large variety of endogenic and xenobiotic (such as drugs, pesticides),
thereby increasing their solubility and helping their excretion from the cell. GSTs can
be found in mammalians, plants, insects, bacteria and fungi. They have also more
functions, like peroxidase, isomerase and dehydroascorbate reductase activity. In
addit ion, GSTs are implicated in the intracellular transport and storage of a broad
range of structurally diverse hydrophobic ligands. GSTs structural flexibilit y allows
exhibit different catalytic functions.
The purpose of the present thesis, was the evaluation of GSTs enzymes that could be
used for the development of simple analytical methods for pesticides determination.
This research can be divided in three parts, with the first one (Chapter 3) describes
results from human GSTs, while the other two (Chapter 4 and 5) deal wit h plant
GSTs.
In the first part human GSTs (hGSTP1*A, hGSTP1*B, hGSTP1*C, hGSTA1-1,
hGSTT2-2 and hGSTO1-1), were expressed and purified using affinit y
chromatography. Then, screening was carried out, for the evaluation of the inhibit ion
potency of these isoenzymes, toward a wide range of insecticides and herbicides. The
purpose of this project, was to develop simple assays for the determination of
pesticides in water samples, based on GSTs use. The insecticides dieldrin and
spiromesifen were identified as potent reversible inhibitors toward hGSTA1-1, with
IC50 values equal to 17.9 ±1.7 μM and 12.1 ±3.4 μM, respectively. Based on in
silico docking analysis and kinetic inhibition studies it was concluded that dieldrin
and spiromesifen bind specifically to the enzyme presumably, at a distinct position
that partially overlaps with both the G- and H-site. The ability of dieldrin and spiromesifen to inhibit hGSTA1-1 activity, was exploited for the development of
analytical quantification assays for these two pesticides. Linear calibration curves
were obtained for dieldrin and spiromesifen, with useful concentration in the range of
0–10 μM. The reproducibilit y of the assay response, expressed by relative standard
deviation, was in the order of 4.1% (N = 28). The method was successfully applied to
the determination of these pesticides in real water samples, without sample
preparation steps. The enzyme-based assays have potential advantages over bioassays
and other analytical methods based on HPLC, in terms of lower cost and technical
complexity. Moreover, they provide reasonable sensitivity for certain applications,
such as the direct determination of pesticide residues in water samples.
Plant GSTs comprise a family of isoenzymes that play essential role in plant defense
under biotic and abiotic stress, as well as in pesticide detoxification. Four GST
isoenzymes from leaves of P.vulgaris, were isolated. Analysis of the cDNA clones,
showed that the deduced amino acid sequences share high homology with GSTs that
belong to phi and tau classes. The isoenzymes were expressed in E. coli and their
substrate specificity was determined towards 20 different substrates. The results
showed that the GSTs from P. vulgaris (PvGSTs), catalyze a broad range of reactions
and exhibit quite varied substrate specificity.
Structural analysis shows that PvGSTs share the same overall structure like others
cytosolic plant GSTs, with differences at their active center and in the C-terminal
domain, as well as in the linker of N- and C- terminal domains. The structural
heterogeneity within the C-terminal domain seems to be responsible for the substrate
variability and specificity across PvGSTs.
After treatment of P.vulgaris and G.max under stress conditions, for the GST
induction, RNA was isolated for cDNA creation, using degenerated primers and
reverse transcription-PCR. Large diversity in GST genes was accomplished
employing directed evolution through DNA shuffling. The shuffled library of new
GST genes was cloned and expressed in E. coli. Screening of the library led to the
isolat ion of a novel GST enzyme that displays both glutathione transferase and
glutathione peroxidase activities. The enzyme was purified by affinity
chromatography and characterized by kinetic analysis towards 20 different substrates
and 66 different pesticides. The results showed that the organocloride insecticides and strobilurins (fungicides) are strong inhibitors of the enzyme. The specificity of the
enzyme towards pesticides was further improved using site-saturation mutagenesis at
position Phe117. Seven new mutants were selected and characterized. The mutant
Phe117Ile displays 5-fold higher catalytic efficiency and higher sensit ivit y towards
organochloride insecticides. Therefore, the mutant GSTPhe117Ile was used for the
research development of an optical biosensor. The enzyme was immobilized in
alkosixylane (TEOS/PTMOS) sol-gel system in the presence of the pH indicators
bromocresol purple (acidic) and phenol red (basic). The bioactive material exhibits
linear regression in the range pH=4-7 at 562 nm and was used for the development of
an analyt ical method for the determinat ion of α-endosulfan. The calibration curve and
analytical range for α-endosulfan determination is 0-30 μM.
