Οι μυκοτοξίνες αποτελούν έναν από τους κυριότερους παράγοντες κινδύνου για την υγεία του
ανθρώπου. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει η ωχρατοξίνη Α (ΩΤΑ), η οποία παράγεται κυρίως από τα
γένη Aspergillus και Penicillium. Η παρουσία ωχρατοξινογόνων μυκήτων και η ανίχνευση της ΩΤΑ
αποτελεί ένα σημαντικό κίνδυνο της ασφάλειας των τροφίμων.
Καταρχάς, στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε μία βιβλιογραφική
ανασκόπηση σχετικά με τους κύριους ωχρατοξινογόνους μύκητες (Aspergillus westerdijkiae, A.
carbonarius και Penicillium verrucosum) και την ΩΤΑ, ενώ οι στόχοι που τέθηκαν προς διερεύνηση
συνοψίζονται: α) στη μελέτη της επίδρασης διαφορετικών οικολογικών παραγόντων όπως το pH, η
ενεργότητα νερού (a
), η μικροδομή (ενδογενείς παράγοντες), η θερμοκρασία (εξωγενής
παράγοντας) και το αρχικό επίπεδο ενοφθαλμίσματος (λοιποί σχετιζόμενοι παράγοντες) στην
ανάπτυξη των μυκήτων και την παραγωγή ΩΤΑ, β) στην ανάπτυξη μοντέλων κινητικής και μοντέλων
πιθανοτήτων στοχεύοντας στην πρόρρηση της ανάπτυξης των μυκήτων και της παραγωγής ΩΤΑ
λαμβάνοντας υπόψη τους προαναφερθέντες παράγοντες και στην επικύρωση των αναπτυχθέντων
μοντέλων σε διαφορετικά τρόφιμα, γ) στη συσχέτιση διαφορετικών μεθόδων εκτίμησης της
ανάπτυξης των μυκήτων (ακτινωτή διάμετρος της αποικίας, ξηρή μυκηλιακή βιομάζα και
πληθυσμός σπορίων) και της παραγωγής ΩΤΑ (ELISA και HPLC) και δ) στη μελέτη και ανεύρεση
πιθανών βιολογικών (π.χ. χρήση μικροοργανισμών- μικτές καλλιέργειες βακτηρίων ή/ και ζυμών) ή
εναλλακτικών μεθόδων (π.χ. χρήση αιθέριων ελαίων-δράση μέσω των πτητικών συστατικών και
ενσωμάτωση σε εδώδιμες επικαλύψεις) στοχεύοντας στην αναστολή της ανάπτυξης των μυκήτων ή
στη μείωση της ΩΤΑ.
w
Συγκεκριμένα, έχοντας ως αφετηρία τις υπάρχουσες βιβλιογραφικές πληροφορίες για την
οικολογία των ωχρατοξινογόνων μυκήτων και τις συνθήκες που ευνοούν την παραγωγή της ΩΤΑ
αλλά και τις προτεινόμενες μεθόδους για τη μελέτη του ελέγχου της παραγόμενης τοξίνης
(Κεφάλαια 1 και 2), σχεδιάστηκε η παρούσα διδακτορική διατριβή. Η υπάρχουσα βιβλιογραφία
πραγματεύεται κυρίως την παραγωγή ΩΤΑ σε εργαστηριακά υποστρώματα. Αντίθετα, η μελέτη της
επίδρασης της οικολογίας των τροφίμων (π.χ. ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες, μικροδομή του
τροφίμου, μικροβιακές αλληλεπιδράσεις) στην αύξηση των μυκήτων και στην παραγωγή ΩΤΑ δεν
έχει μελετηθεί επαρκώς. Παράλληλα με τη βοήθεια της μικροβιολογίας πρόρρησης δόθηκε η
δυνατότητα να αναπτυχθούν μοντέλα (κινητικά ή στοχαστικά) ικανά να προβλέπουν παραμέτρους
σχετιζόμενες με την ανάπτυξη των μυκήτων (π.χ. ρυθμός ανάπτυξης, χρόνος εμφάνισης της υφής
του μύκητα) και την παραγωγή της ΩΤΑ (π.χ. ρυθμός παραγωγής, χρόνος κατά τον οποίο η τοξίνη
καθίσταται ανιχνεύσιμη) σε συνάρτηση με τους προαναφερθέντες παράγοντες. Τέτοιου είδους
προσεγγίσεις ενδέχεται να συμβάλουν επιπλέον στην ανεύρεση μεθόδων ελέγχου της παραγωγής ΩΤΑ. Ως δευτερεύων στόχος αλλά εξίσου σημαντικός τέθηκε η διερεύνηση της εφαρμογής της
πληρέστερης δυνατής μεθοδολογίας για τον προσδιορισμό τόσο βιολογικών μεθόδων
στηριζόμενων σε μικροοργανισμούς τεχνολογικής σημασίας όσο και φυσικών αντιμικροβιακών (π.χ.
αιθέρια έλαια) για την παρεμπόδιση της ανάπτυξης ωχρατοξινογόνων μυκήτων και τη μείωση της
παραγωγής ΩΤΑ σε εργαστηριακά υποστρώματα (in vitro) με συνιστώσες, οικολογικούς παράγοντες
και τη συγκέντρωση της αντιμικροβιακής ουσίας. Η μελέτη στα τρόφιμα έγινε με πειράματα
ενοφθαλμισμού (challenge tests) μυκήτων σε προϊόντα που περιείχαν τη φυσική τους
μικροχλωρίδα (in situ) συντηρούμενα σε διαφορετικές θερμοκρασίες.
Πρωταρχικά λοιπόν (Κεφάλαιο 3), μελετήθηκε η in vitro επίδραση διαφορετικών συνδυασμών
οικολογικών παραγόντων όπως το pH, η a
, και η θερμοκρασία στην παραγωγή ΩΤΑ από τους
μύκητες A. westerdijkiae, A. carbonarius και P. verrucosum με τη χρήση της ανοσοενζυμικής
μεθόδου ELISA έχοντας ως στόχο τον προσδιορισμό τόσο των άριστων όσο και των οριακών
συνθηκών για την παραγωγή της τοξίνης. Εν συνεχεία, η ΩΤΑ προσδιορίστηκε σε αντιπροσωπευτικό
αριθμό δειγμάτων με τη μέθοδο της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC).
Πραγματοποιήθηκε λοιπόν σύγκριση μεταξύ των δύο μεθόδων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης
της ΩΤΑ, στοχεύοντας στην εκτίμηση της ακρίβειας και της αποδοτικότητας μίας ταχείας, χαμηλού
κόστους αλλά ημι-ποσοτικής μεθόδου όπως η ELISA συγκριτικά με τη συμβατική μέθοδο της HPLC.
w
Ακολούθως, η έρευνα εστιάστηκε στο ανοιχτό ακόμη για τους ερευνητές ζήτημα της επίδρασης
της μικροδομής του υποστρώματος (υγρό, ημίρρευστο, στερεό) και τον τρόπο που επηρεάζει την
ανάπτυξη του A. carbonarius (είδος μύκητα που αναπτύσσεται σε διαφορετικής μικροδομής
τρόφιμα) και την παραγωγή της ΩΤΑ συνδυαστικά και με άλλους οικολογικούς παράγοντες όπως το
pH, την a
, και την θερμοκρασία (Κεφάλαιο 4). Λαμβάνοντας υπόψη τα πειραματικά δεδομένα
αναπτύχθηκαν μαθηματικά μοντέλα ικανά να προβλέπουν τους ρυθμούς της ανάπτυξης του
μύκητα και της παραγωγής της ΩΤΑ συναρτήσει των προαναφερθέντων παραγόντων και
επικυρώθηκαν σε τρόφιμα διαφορετικού ιξώδους (κρέμα, ζελέ και μαρμελάδα).
w
Συμπληρώνοντας το πρώτο πειραματικό σκέλος που αφορούσε τη μελέτη οικολογικών και μη
παραγόντων που είναι ικανοί να επηρεάσουν την ανάπτυξη των μυκήτων και την παραγωγή της
ΩΤΑ και δεδομένων των περιορισμένων βιβλιογραφικών πληροφοριών που υπάρχουν, ως προς
μελέτη παράγων επιλέχθηκε το μέγεθος του αρχικού ενοφθαλμίσματος (Κεφάλαιο 5).
Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η κινητική εκβλάστησης μεμονωμένων σπορίων αλλά και ανάπτυξης και
παραγωγής ΩΤΑ αποικιών προερχόμενων από μεμονωμένα σπόρια των μυκήτων A. westerdijkiae,
A. carbonarius και P. verrucosum σε διαφορετικές συνθήκες pH, a
και θερμοκρασίας. Λαμβάνοντας
υπόψη τα πειραματικά δεδομένα, μοντελοποιήθηκαν ο χρόνος εμφάνισης της μυκηλιακής υφής και
ο χρόνος κατά τον οποίο η ΩΤΑ καθίσταται ανιχνεύσιμη με τη χρήση της προσομοίωσης Monte Carlo. Η εκτίμηση της απόδοσης των αναπτυχθέντων μοντέλων πραγματοποιήθηκε στις ίδιες
πειραματικές συνθήκες (θρεπτικό υπόστρωμα, pH, a
και θερμοκρασία), ενώ χρησιμοποιήθηκε
αρχικό ενοφθάλμισμα εύρους 1-10
5
w
σπόρια.
Το δεύτερο και εξίσου βασικό σκέλος της παρούσας διδακτορικής διατριβής συνοψίζεται στην
ανεύρεση μικρο(βιολογικών) μεθόδων αναστολής της ανάπτυξης μυκήτων και μείωσης της
παραγόμενης ΩΤΑ. Γι’ αυτό το λόγο, στο παρόν κεφάλαιο (Κεφάλαιο 6) μελετήθηκε η ικανότητα
μικτών καλλιεργειών βακτηρίων και ζυμών τεχνολογικής σημασίας (μικροοργανισμοί που δύναται
να χρησιμοποιηθούν ως εναρκτήριες ή προστατευτικές καλλιέργειες) να αναστέλουν την ανάπτυξη
του A. carbonarius και να μειώνουν την ΩΤΑ υπό διαφορετικές πειραματικές συνθήκες (αρχική
συγκέντρωση της ΩΤΑ, pH, θερμοκρασία και μέγεθος του ενοφθαλμίσματος της εκάστοτε
καλλιέργειας βακτηρίων ή ζυμών και μύκητα) τόσο σε θρεπτικά υποστρώματα όσο και σε ποτά
(χυμός σταφυλιού, κρασί και μπύρα).
Το τελευταίο κεφάλαιο σχεδιάστηκε πειραματικά υπό το πρίσμα της ανεύρεσης εναλλακτικών
μεθόδων αναστολής της ανάπτυξης του μύκητα A. carbonarius και της παραγωγής ΩΤΑ με τη χρήση
φυσικών αντιμικροβιακών (Κεφάλαιο 7). Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η δράση διαφορετικών
συγκεντρώσεων αιθέριου ελαίου κανέλας κατά την εφαρμογή μέσω άμεσης (ενσωμάτωση σε
εδώδιμες επικαλύψεις αλγινικού νατρίου) και έμμεσης επαφής (προσθήκη εμποτισμένου χαρτιού
στη κύρια συσκευασία- δράση μέσω των πτητικών συστατικών) στη σάρκα και το φλοιό, μήλων και
αχλαδιών, ενοφθαλμισμένων με τον A. carbonarius κατά τη συντήρησή τους σε διαφορετικές
θερμοκρασίες και υπό αερόβιες συνθήκες.
Οι πληροφορίες που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της παρούσας διδακτορικής διατριβής
δύναται να συμβάλουν στην πληρέστερη κατανόηση των κινδύνων όπως την ανάπτυξη και την
παραγωγή της ΩΤΑ των A. westerdijkiae, A. carbonarius και P. verrucosum, να ενισχύσουν τις ήδη
υπάρχουσες στρατηγικές για την αντιμετώπισή τους και να αποτελέσουν έναυσμα για περαιτέρω
μελέτη και έρευνα με στόχο την αποτελεσματική πρόληψή τους.
Some filamentous fungi of the genera Aspergillus and Penicillium are of high impact for food
safety due to their ability to produce a toxic secondary metabolite, ochratoxin A (OTA). OTA is well
known for its carcinogenic, immunosuppressive and teratogenic properties. OTA has also been
extensively documented as a contaminant of a wide variety of foods including cereals, green coffee,
spices, nuts, dried fruits, beer, wine, grapes, and grape juice. Following, a literature review on OTA
and existing knowledge of three main ochratoxigenic fungi (Aspergillus westerdijkiae, A. carbonarius
and Penicillium verrucosum) the objectives of the present thesis were: i) to study the effect of
different ecophysiological factors such as pH, a
, microstructure (intrinsic factors), temperature
(extrinsic factor), and initial inoculum level (implicit factors) on fungal growth and OTA production, ii)
to develop kinetic or stochastic models by using the primary data in order to predict fungal growth
and OTA production and validate the aforementioned models on different foodstuffs, iii) to correlate
different evaluation methods regarding fungal growth (colony diameter, dry fungal biomass, and
spores population) and OTA production (ELISA and HPLC analysis), and iv) to study potential
biological (e.g., microorganisms- bacterial and yeast composites) or alternative methods (e.g.,
essential oils- vapor phase and enclosed in edible coatings) for fungal inhibition and OTA reduction.
w
At preliminary stage (Chapter 3), the potential of the ELISA method in the determination of the
produced OTA by A. westerdijkiae, A. carbonarius and P. verrucosum in Malt Extract Agar at different
pH (3.9, 5.1, 5.9 and 6.8), a
(0.87, 0.93 and 0.99), and temperature (10, 15, 20, 25, 30 and 40°C)
levels was evaluated, providing a rapid screening for the optimum and marginal conditions of OTA
production. Moreover, selected samples were analyzed for OTA by HPLC in order to verify ELISA
method. The knowledge of optimal and marginal levels of ecological factors in order to optimize
post-harvest and storage of food products may significantly affect the production of OTA.
w
Following this screening, the study was focused on food microstructure (e.g., liquid, semi-liquid,
solid) (expressed as % w/v gelatin) and how it may affect growth and OTA production of A.
carbonarius in combination with factors such as a
, pH and temperature (Chapter 4). The primary
data were used in order to develop secondary (kinetic) models for growth and OTA production rates
by A. carbonarius. Finally, the performance of the developed models was evaluated in food matrices
of different viscosity such as jelly, custard and marmalade. The findings of this chapter may provide a
basis for reliable assessment of the risk of fungal growth and OTA production in foods of different
structural and rheological properties.
w
At a next step, germination, fungal growth and OTA production kinetics of A. westerdijkiae, A.
carbonarius and P. verrucosum single spores were evaluated on Malt Extract Agar of different pH
and a
w
values, incubated at different temperatures (Chapter 5). Fungal growth was determined by measuring the radial growth rate (RGR) and time-to-visible growth (TTVG) of colonies resulting from
single spores, while OTA production from individual colonies was also tested. Monte Carlo
simulations (10000 iterations) were used to model TTVG and time for OTA detection of various spore
populations, assuming that spores behave independently. Simulations agreed well with validation
data, suggesting that these findings may be used for risk assessment of OTA production based on the
variability in responses of individual spores.
With respect to (micro)biological control, composites of yeast and bacterial isolates from
fermented products were studied, in order to assess their ability to inhibit A. carbonarius growth
and reduce OTA concentration in culture media and beverages (Chapter 6). The antagonistic effect
of the above composites against A. carbonarius growth was studied in Synthetic Grape Medium of
pH 3.5 and a
0.98, 0.95, 0.92 after incubation at 25°C. Different combinations of initial inocula of
bacteria or yeast composites and fungi were used, in order to study antagonism between
microorganisms. Regarding the OTA reduction experiment, different inocula of bacteria and yeast
composites were inoculated in liquid media of different pH (3.0, 4.0, 5.0, and 6.1 or 6.5) and initial
OTA concentration (50 and 100 ppb) and beverages e.g., grape juice, red wine, and beer to estimate
the kinetics of OTA reduction. Fungal inhibition and OTA reduction were calculated in comparison to
control samples. Such findings may assist in the control of A. carbonarius growth and OTA
production in fermented foodstuffs by the use of proper strains of technological importance.
w
Finally, given that ochratoxigenic fungi contaminate fruits through damaged or wounded tissues
and release toxin under improper storage conditions, essential oil (EO) of cinnamon was used as
natural antimicrobial agent (Chapter 7). Skin (intentionally wounded by puncturing) and flesh of
apples and pears were used as substrates for A. carbonarius growth and OTA production. The EO
activity was estimated through direct (addition in alginate coatings) and indirect (volatile compounds
of cinnamon EO) contact with the fruits. Samples without any treatment served as controls. All
samples were stored at 15, 20 and 25°C. Fungal growth was estimated by colony diameter
measurements and spores density (log spores/ g) on MEA, while OTA production was determined by
HPLC.
The findings of the present PhD thesis may contribute to the better understanding of hazards
such as growth and OTA production of A. westerdijkiae, A. carbonarius and P. verrucosum, to enforce
the already existing prevention strategies and to deliver several new insights and tools
(mathematical models) which may be useful for food safety management of fungal growth and OTA
production by constituting also a fuel for further study and research.
