Εκτίμηση της αλλοίωσης του κρέατος με σύγχρονες μεθόδους

Abstract

Το κρέας εξαιτίας της υψηλής περιεκτικότητας σε νερό και της αφθονίας σε θρεπτικά συστατικά θεωρείται ένα από τα πιο ευαλλοίωτα τρόφιμα. Η αλλοίωση του κρέατος είναι ένα οικολογικό φαινόμενο το οποίο αποδίδεται σχεδόν ολοκληρωτικά στη μικροβιακή δραστηριότητα. Η μικροβιακή αλλοίωση προκαλεί το σχηματισμό γλοιώδους υφής και δυσάρεστων οσμών, κάνοντας το ανεπιθύμητο στον καταναλωτή. Είναι λοιπόν σημαντικό, να βρεθούν γρήγορα και αξιόπιστα συστήματα ώστε να μπορεί να παρακολουθείται η ποιότητα και φρεσκάδα του κρέατος κατά την παραγωγή και διάθεση του. Ο γενικός στόχος της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός της αλλοίωσης του κρέατος με διαφορετικές ταχείες αναλυτικές τεχνικές. Η μικροβιολογική εξέλιξη της χλωρίδας του κρέατος παρακολουθούνταν παράλληλα με το μεταβολικό της προφίλ. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν δύο διαφορετικά πειράματα. Στο πρώτο πείραμα, που αφορούσε αλλοίωση χοιρινού κιμά σε πέντε διαφορετικές θερμοκρασίες (0, 5, 10, 15 και 20°C) και δύο συσκευασίες (αέρας και ΜΑΡ), εφαρμόστηκαν ποικίλες ταχείες αναλυτικές τεχνικές με σκοπό να διερευνηθούν οι βιοχημικές αλλαγές κατά τη διάρκεια της αλλοίωσης του κρέατος. Στο δεύτερο πείραμα έγινε εμβολιασμός στείρου ιστού κρέατος με επιλεγμένους μικροοργανισμούς σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες (4 και 10°C) και δύο συσκευασίες (αέρας και ΜΑΡ), με σκοπό τη μελέτη των μεταβολικών προϊόντων που παράγονται κατά τη συντήρηση του κρέατος. Οι αναλυτικές τεχνικές που εφαρμόστηκαν στη μελέτη αυτή, ήταν φασματοσκοπία υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FTIR), ηλεκτρονική μύτη (Libra Nose), υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC), αέρια χρωματογραφία/φασματοσκοπία μάζας με μικροεκχύλιση στερεής φάσης (HP/SPME, GC/MS) και διάφορες μοριακές τεχνικές (Rep-PCR, Sau-PCR και PFGE) ώστε να εξεταστεί η ποικιλομορφία, του βακτηρίου Β. thermosphacta σε επίπεδο στελέχους, το οποίο απομονώθηκε από χοιρινό κιμά από το επιλεκτικό υπόστρωμα για τον Brochothrix spp. Κατά την ανάλυση με FTIR, και στα δύο πειράματα διαπιστώθηκε καλή διάκριση μεταξύ των ποιοτικών κατηγοριών του δείγματος, οι οποίες αντιστοιχούν σε διαφορετικά επίπεδα αλλοίωσης. Επιπροσθέτως, η πρόβλεψη του κάθε μικροβιακού πληθυσμού ξεχωριστά, απευθείας από τα φασματικά δεδομένα, έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα. Η μελέτη των πτητικών χαρακτηριστικών του χοιρινού κιμά με την ηλεκτρονική μύτη, κατέδειξε πως οι αποκρίσεις των αισθητήρων που συλλέχθηκαν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πτητικά δακτυλικά αποτυπώματα μίας ενεργής βιολογικής ουσίας, τα οποία περιέχουν πληροφορίες για την ποιότητά της, η οποία αντιστοιχεί σε διαφορετικά επίπεδα αλλοίωσης καθώς μπορούσε να προβλέψει αποτελεσματικά την ποιοτική κατηγορία ενός δείγματος. Η ανάλυση με HPLC οδήγησε στην επιλογή 16 ουσιών και από τα αποτελέσματα βρέθηκε πώς τα 16 οργανικά οξέα δεν σχετίζονταν για όλες τις περιπτώσεις με τη θερμοκρασία ή τη συσκευασία. Τέλος, η ανάλυση του μεταβολικού προφίλ των οξέων σε συνδυασμό με πολυμεταβλητές στατιστικές μεθόδους (PLS-DA, ανάλυση διακύμανσης, DFA, και SVM) έδωσαν ικανοποιητικά αποτελέσματα. Η ανάλυση με HS/SMPE GC/MS παρείχε χρήσιμες πληροφορίες για τις πτητικές ενώσεις που είναι παρούσες κατά τη συντήρηση του χοιρινού κιμά και στείρου ιστού χοιρινού κρέατος σε διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας και συσκευασίας. Οι ουσίες που προσδιορίστηκαν βρέθηκαν να είναι εξαρτώμενες από τη θερμοκρασία ή/και τη συσκευασία συντήρησης των δειγμάτων κρέατος που εξετάστηκαν, καθώς κατά τη διάρκεια της αλλοίωσης σε διαφορετικές συνθήκες οι ουσίες αύξησαν ή μείωσαν τη συγκέντρωσή τους διαφορετικά κατά περίπτωση συσκευασίας και θερμοκρασίας. Τέλος, εξετάστηκε η ποικιλομορφία, καθώς και η εξέλιξη του βακτηρίου Β. thermosphacta όπου διαφορετικά αποτελέσματα προέκυψαν από τις διαφορετικές μεθόδους το οποίο αποδίδεται στον διαφορετικό βαθμό διακριτικής ικανότητας της κάθε μοριακής μεθόδου. Σε αυτήν την μελέτη, παρατηρήθηκε μια σημαντική ποικιλομορφία μεταξύ των απομονώσεων που ανακτήθηκαν από την αερόβια συντήρηση του χοιρινού κιμά, ενώ για τα στελέχη που ανακτήθηκαν από τα δείγματα που συντηρήθηκαν σε συνθήκες ΜΑΡ η ετερογένεια ήταν χαμηλότερη ενώ βρέθηκε πως όλα τα όλα τα στελέχη ανήκουν στο είδος Brochothrix thermosphacta.

Quality is generally a subjective and sometimes elusive term. It is generally accepted that detectable organoleptic spoilage is a result of decomposition and the formation of metabolites caused by the growth of microorganisms. It is therefore crucial to have valid methods to monitor freshness and quality. The ideal method for the on-line microbiological analysis of meat would be rapid, non-invasive, reagentless, and relatively inexpensive and these requirements can be met via the application of a spectroscopic approach, in combination with any appropriate data analysis strategy based on statistics or machine learning. In the current thesis, the microbial association of meat was monitored in parallel with the chemical changes, pH measurements and sensory analysis. For this purpose, two different experiments were designed and several chemical analytical techniques were applied to quantify biochemical changes in an attempt to monitor meat spoilage. In the first experiment, fresh minced pork was stored aerobically and under modified atmospheres packaging (MAP) at five different temperatures (0, 5, 10, 15 and 20°C) and microbiological analysis in terms of total viable counts, Pseudomonas spp., Brochothrix thermosphacta, lactic acid bacteria, Enterobacteriaceae and yeast and moulds was performed in parallel with Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, electronic nose (Libra Nose), high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography/mass spectroscopy (HS/SPME GC/MS), and several molecular techniques (Rep-PCR, Sau-PCR and PFGE). In the second experiment sterile tissue of pork meat fillet was inoculated with selected spoilage microorganisms at two different temperatures (4 and 10°C) and two packaging conditions (air and MAP), in order to study the metabolic profile produced during storage of meat with GC/MS. The first component of the study was designed to evaluate the potential of FTIR spectroscopy as a rapid analytical technique in order to quantify biochemical changes occurring in fresh minced meat in the attempt to monitor spoilage. The obtained results demonstrated good performance in classifying meat samples in one of the three pre-defined sensory classes. The performance of a portable e-nose has been evaluated in monitoring minced pork spoilage at different storage and packaging conditions. The obtained results demonstrated good performance in discriminating meat samples in one of the three pre-defined quality classes. Additionally, SVM regression model development, can be efficiently used for the estimation of the population of various microbial groups, which was demonstrated by the correlation for each group of microorganism. Two further studies were conducted using rapid analytical methods such as HPLC analysis of organic acids and GC/MS to monitor the changes in organic acids and volatile compounds respectively, which are present in the meat substrate during storage. The applied PLS-R models gave estimations of the different microbial populations (e.g. TVC: 0.792 for the HPLC and 0.866 for the GC/MS models) and the FDA facilitated the discrimination of the samples regarding their freshness (correct classification of 97.60% for HPLC and 76.06% for GC/MS). Additionally, the GC/MS was used to identify the volatile compounds present in the sterile meat. Interesting information about the evolution of spoilage under different group of inoculated microorganism and different temperature and packaging conditions was demonstrated. Finally, a total of 306 colonies were isolated from the selective medium for Brochothrix spp., during the spoilage of minced pork. Brochothrix biodiversity was assessed by (PFGE), and representative strains were further analyzed by Rep-PCR and Sau-PCR. Although, different results were obtained from the different methods, a significant diversity among isolates recovered from aerobic conditions was observed. A representative number of isolates, based on the results of the clustering by molecular methods, were subjected to 16S rRNA gene sequencing, revealing that all belonged to Brochothrix thermosphacta.