Green methods for methyl esters determination in foodstuffs

Abstract

Αυτή η διδακτορική διατριβή περιγράφει την ανάπτυξη νέων, πράσινων μεθόδων για τον προσδιορισμό μεθυλεστέρων στα τρόφιμα. Οι μέθοδοι βασίζονται σε ενζυματικές αντιδράσεις και ρευστών. Η διατριβή επικεντρώνεται σε δύο μεθυλεστέρες: μεθυλεστέρας της πηκτίνης και ο ασπαρτάμη - ένας μεθυλεστέρας του ασπαρτικού οξέος / διπεπτίδιου της φαινυλαλανίνης. Οι μέθοδοι που αναπτύχτηκαν βασίζονται στην ενζυμική υδρόλυση προς μεθανόλη. Το στάδιο της υδρόλυσης ακολουθείται από προσδιορισμό μεθανόλης. Διάφοροι μέθοδοι προσδιορισμού μεθανόλης έχουν αξιολογηθεί, με 4-αμινοαντιπυρίνη (4-AAP) και φαινόλη η πιο κατάλληλο για αυτοματοποίηση. Η μέθοδος αυτή βελτιστοποιήθηκε για την συγκέντρωση οξειδάσης της αλκοόλης. Αξιολογήθηκε η επίδραση του pH και της θερμοκρασίας, καθώς και επίσης η μακροπρόθεσμη σταθερότητα του διαλύματος εργασίας των ενζύμων. Εξάλειψη της επίδρασης του ασορβικού οξέως με χρήση 4-υδροξυ-ΤΕΜΡΟ εξετάσθηκε. Προσδιορισμό δύον αυτοματοποιημένων μεθόδων για προσδιορισμό μεθυλεστέρων περιγράφεται: αναλυτή φασματοφωτομετρική μεθόδου για μεθυλεστέρες της πηκτίνης και χημειοφωταύγειας για προσδιορισμό ασπαρτάμης. Η μέθοδος για μεθυλεστέρες είναι η πρώτη που αναπτύχθηκε για τον ποιοτικό έλεγχο της πηκτίνης με τεχνολογίες ροής. Επιτεύχθηκε όριο ανίχνευσης 1.47 mM με ταχύτητα ανάλυσης 7 h-1 ενώ τα αποτελέσματα είναι ισοδύναμα με αυτά που πετυχαίνονται με την συνήθως χρησιμοποιούμενη μη αυτοματοποιημένη μέθοδο όπως δείχνει σύγκριση με την δοκιμασία t. Αρχικό στάδιο αναλυτή ροής για προσδιορισμό ασπαρτάμης είναι η ανάπτυξη κινητικής μεθόδου προσδιορισμού ασπαρτάμης που δείχνει καλά αποτελέσματα σε δείγματα νερού που περιέχει υψηλές συγκεντρώσεις ασπαρτάμης. Όπως έδειξε η προκαταρκτική μελέτη, για την ανάπτυξη της αυτοματοποιημένης μεθόδου επιλέχθηκε η χημιοφωταύγεια ως τεχνική ανίχνευσης. Διάφορα συστήματα διαύλων κατασκευάστηκαν για μελέτη των κάτωθι παραμέτρων: ταχύτητα ροής, μήκος, θέση και αριθμός των σπειραμάτων αντίδρασης, χρόνος προεπώασης, επίδραση της συγκέντρωσης της οξειδάσης της αλκοόλης και χρήσης της με χωριστό διάλυμα. Tαχύτητες ροής 0,8 ml/min/δίαυλο σε συνδιασμό με ένα σπείραμα 100 cm εκατοστά, προεπώαση 60 s και διαχωρισμό των ενζύμων οδήγησαν σε αναλυτικό σήμα που επέτρεψε την κατασκευή καμπύλης βαθμονόμησης στο εύρος των συγκεντρώσεων ασπαρτάμης που ενδιαφέρει την ανάλυση τροφίμων. Επιπλέον, οι ακόλουθες ανεπιθύμητες έργα περιγράφεται: ανάπτυξη προσδιορισμού της δραστικότητας της μεθυλεστεράσης της πηκτίνης και προσδιορισμό γαλακτουρονικό οξύ.

In this thesis development of novel, green methods for methyl esters in foodstuffs is described. Methods are based on enzymatic reactions and fluidics. Study focuses on two methyl esters: pectin methyl ester and aspartame, a methyl ester of aspartic acid/phenylalanine dipeptide. Pectin and aspartame are enzymatically hydrolysed by pectin methylesterase or α-chymotrypsin, respectively. Methanol is released and quantified. Several methanol determination methods have been tested, with the method with 4-AAP and phenol showing the best prospects for automation. Method was optimized and its robustness was investigated. Ascorbic acid interference removal with 4-hydroxy TEMPO was tested. Development of two automated methods for methyl esters determination is described: spectrophotometric pectin methyl esters determination and chemiluminescent aspartame determination.The method for pectin methyl esters is the first work on pectin analysis through flow injection. Detection limit down to 1.47 mM was achieved at the analysis rate of 7 samples h-1. The method provides identical results with manual off-line method. The development of the aspartame analyzer was preceded by the development of a spectrophotometric method, which showed good results in samples containing higher aspartame concentrations than expected in beverages. In order to improve method for possible application in beverages chemiluminescent detection was selected for the automated method. The chemistry from kinetic study was modified to accommodate luminol chemiluminescent detection and optimization of the system was performed. Several manifolds were constructed and the effect of following parameters was tested: flow rate, mixing coils length, location and number, preincubation time, alcohol oxidase concentration, use of separate solutions of AOX and HRP. 0.8 ml/min/line flow rate in combination with one 100 cm mixing coil, 60 s preincubation and use of separated solutions of AOX an HRP resulted in sufficient sensitivity that allowed for construction of a calibration curve within the range of aspartame concentration found in diet drinks. Additionally, following side projects related to the main topic of the study are described: development of PME activity assay and galacturonic acid determination.