Μοριακή και λειτουργική ανάλυση της προνυμφικής ανάπτυξης των εντόμων

Abstract

Η ανάπτυξη των εντόμων είναι ένας σύνθετος μηχανισμός που ρυθμίζεται από πλειάδα παραγόντων, τόσο μοριακών, βιοχημικών και ορμονικών όσο και από το περιβάλλον. Όσον αφορά την μοριακή ρύθμιση της ανάπτυξης, το γονίδιο της εστεράσης της ορμόνης νεότητας (juvenile hormone esterase, JHE), το γονίδιο του υποδοχέα των εκδυστεροειδών (Ecdysone receptor, EcR) και το γονίδιο του υποδοχέα USP, (Ultraspiracle, USP), αποτελούν τους κυρίαρχους ενορχηστρωτές της αναπτυξιακής διαδικασίας των εντόμων. Οι ορμόνες νεότητας (juvenile hormones, JHs), ασκούν πλείστες λειτουργίες κατά την διάρκεια του βιολογικού κύκλου των εντόμων. Σε συνεργασία με τα εκδυστεροειδή, ρυθμίζουν την μετάβαση των εντόμων στα διάφορα αναπτυξιακά τους στάδια και οργανώνουν τις μεταμορφωτικές των δραστηριότητες. Οι JHs λειτουργούν απευθείας ως ρυθμιστικοί παράγοντες των γονιδίων, ενώ μέσω έμμεσης ρύθμισης απενεργοποιούν γονίδια που έχουν επαχθεί από την 20-υδροξυεκδυσόνη (20E). Οι εστεράσες της ορμόνης νεότητας, (juvenile hormone esterases, JHEs), ανήκουν στην ευρύτερη οικογένεια των a/b υδρολασών. Είναι υψηλής εκλεκτικότητας ένζυμα, τα οποία διασπούν τις JHs ακόμα και αν αυτές βρίσκονται σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις. Ο σημαντικός βιολογικός τους ρόλος έγκειται στο γεγονός ότι ρυθμίζουν τον τίτλο των ορμονών νεότητας στην αιμολέμφο των εντόμων και κατά συνέπεια ρυθμίζουν την φύση της έκδυσης. Οι εκδυσόνες προετοιμάζουν τα κύτταρα για την μίτωση, την απόπτωση, την απόλυση, την εναπόθεση συστατικών του εξωσκελετού και την έκδυση. Είναι προ-ορμόνες και δέν επηρεάζουν άμεσα την διαδικασία των εκδύσεων. Μετατρέπονται στην 20- υδροξυεκδυσόνη στα λιπώδη ή επιδερμικά κύτταρα. Η 20-υδροξυεκδυσόνη προσδένεται εκλεκτικά στον υποδοχέα της εκδυσόνης, (ecdysone receptor, EcR), έναν μεταγραφικό παράγοντα που ενεργοποιείται μόνο ύστερα από την πρόσδεση των εκδυστεροειδών. Ο ενεργός EcR οδηγεί στην ενεργοποίηση της μεταγραφής πολλών γονιδίων. Αυτή η ενεργοποίηση οδηγεί σε ένα μονοπάτι πρόκλησης φυσιολογικών αλλαγών που οδηγούν στην αποβολή της γηραιότερης επιδερμίδας και στη δημιουργία νέας. Ο ΕcR στα έντομα σχηματίζει ένα ετεροδιμερές με το προϊόν του γονιδίου USP, (Ultraspiracle), που αποτελεί ορθόλογο των γονιδίων των θηλαστικών FXR και RXR. Τo σύμπλοκo ΕcR/USP αναγνωρίζει ειδικές μικρού μεγέθους αλληλουχίες DNA, σε προαγωγείς γονιδίων που ενεργοποιούνται ως απάντηση στα εκδυστεροειδή. Επιπροσθέτως, ανθρωπογενείς και μη παράγοντες που επιβαρύνουν τα ενδιαιτήματα στα οποία αναπτύσσονται και τρέφονται τα έντομα, όπως είναι τα ξενοβιοτικά- ξενοοιστρογόνα, μπορούν και δρουν απ’ευθείας στην αναπτυξιακή διαδικασία των εντόμων, με άμεσο αποτέλεσμα την τροποποίηση ή/και την πλήρη αποδιοργάνωση της. Η δισφαινόλη- Α (Bispenol-A) είναι μία χημική ένωση που χρησιμοποιείται στην παραγωγή των πολυκαρβονικών πλαστικών (PC polycarbonates) και των εποξυ-ρητινών (epoxyresins). Ως ξενοοιστρογόνο μιμείται την δράση των φυσικών οιστρογόνων, αλληλεπιδρώντας με διάφορους ορμονικούς υποδοχείς, ενώ στα έντομα αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα EcR/USP παρεμβαλλόμενη στην εκδυσιολογική τους διαδικασία. Ο σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής ήταν η λειτουργική και η βιοχημική ανάλυση των πιο σημαντικών μοριακών παραγόντων που ελέχγουν και καθορίζουν την ανάπτυξη των εντόμων, δηλαδή των γονιδίων που κωδικοποιούν για τις εστεράσες των ορμονών νεότητας, του γονιδίου που κωδικοποιεί για τον υποδοχέα των εκδυστεροειδών και του γονιδίου που κωδικοποιεί για τον υποδοχέα USP καθώς και η μελέτη της σχέσης τους με διάφορα ορμονικά ανάλογα καθώς και τα ξενοβιοτικά-ξενοοιστρογόνα. Για την μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν ως πειραματικά έντομα, το λεπιδόπτερο έντομο Sesamia nonagrioides, (Lepidoptera: Noctuidae) και το κολεόπτερο έντομο-μοντέλο Tribolium castaneum, (Coleoprera: Tenebrionidae). Τα έντομα αυτά χρησιμοποιήθηκαν ως πειραματικοί οργανισμοί για την ευκολία που παρέχουν στην μελέτη σημαντικών κεφαλαίων της Εντομολογικής επιστήμης, όπως είναι η μοριακή ενδοκρινολογία, η βιοχημεία και η φυσιολογία, η καταπολέμηση και η βιοτεχνολογία των εντόμων, καθώς και για το γεγονός ότι αναπτύσσονται και αναπαράγονται στο εργαστήριο σε τεχνητή τροφή, ολοκληρώνοντας σχετικά γρήγορα τον βιολογικό τους κύκλο. Επίσης το Tribolium castaneum έχει προσφάτως αλληλουχηθεί, ενώ η ανάπτυξή του είναι περισσότερο αντιπροσωπευτική συγκρινόμενη με τα υπόλοιπα έντομα, γεγονός που αντικατοπτρίζεται στην λειτουργικότητα των γονιδίων του. Η συστημική RNA αποσιώπηση στο Τ. castaneum λειτουργεί διαφορετικά από εκείνη του νηματώδους Caenorhabditis elegans, αλλά εντούτοις προσφέρει παρόμοια δυναμική για την μελέτη της λειτουργίας γονιδίων και τον προσδιορισμό των στόχων για επιλεκτικό έλεγχο του πληθυσμού των εντόμων. Για την μελέτη των διαδικασιών που περιγράφτηκαν προηγουμένως, χρησιμοποιήθηκαν διάφορες καινοτόμοι μέθοδοι μοριακής βιολογίας και βιοχημείας των εντόμων, όπως είναι η dsRNA-κατευθυνόμενη γονιδιακή αποσιώπηση (RNA interference, RNAi), η ετερόλογη έκφραση πρωτεϊνών σε κυτταρικές σειρές λεπιδοπτέρων εντόμων, η χρήση ανασυνδυασμένων βακουλοϊών για την αποσιώπηση και την υπερέκφραση γονιδίων, η γονιδιωματική ανάλυση κλπ., μερικές εκ των οποίων αναπτύσσονται πρώτη φορά σε Ελληνικό έδαφος. Η ανάπτυξη των τεχνικών αυτών, διευκολύνει την επίλυση βασικών βιολογικών προβλημάτων στο επίπεδο της μοριακής βιολογίας της ανάπτυξης των εντόμων, ενώ παρέχει καινοτόμα εργαλεία για την εφαρμοσμένη έρευνα στον τομέα της Βιοτεχνολογίας και πιο συγκεκριμένα στον τομέα της Βιοτεχνολογικής καταπολέμησης των εντόμων. Στο S. nonagrioides χαρακτηρίστηκε μοριακά μια οικογένεια γονιδίων που κωδικοποιεί για συγγενικές εστεράσες της ορμόνης νεότητας, (JHE-related genes), ενώ ένα μέλος τους, το γονίδιο SnJHER, αναλύθηκε σε λειτουργικό και βιοχημικό επίπεδο. Για την λειτουργική ανάλυση του SnJHER χρησιμοποιήθηκαν τρεις προσεγγίσεις αποσιώπησης γονιδίων, είτε μέσω γενετικά ανασυνδυασμένων βακουλοϊών και βακτηρίων, είτε μέσω της απ’ ευθείας ένεσης δίκλωνων μορίων RNA στην αιμολεμφική κοιλότητα των εντόμων. Η λειτουργική ανάλυση έδειξε πως το SnJHER εμπλέκεται τόσο στην ρύθμιση της προνυμφικής- προνυμφικής έκδυσης όσο και στην ρύθμιση της προνυμφικής-νυμφικής και νυμφικής- ενήλικης μετάβασης. Για τον βιοχημικό χαρακτηρισμό του SnJHER, το γονίδιο εκφράστηκε ετερόλογα σε κυτταρικές σειρές λεπιδοπτέρων εντόμων είτε με χρήση ευκαρυωτικών φορέων έκφρασης, είτε με χρήση γενετικά ανασυνδυασμένων βακουλοϊών. Επίσης έγιναν βιοδοκιμές υπερέκφρασης του SnJHER σε προνύμφες του S. nonagrioides. Η αποσιώπηση του SnJHER στην L5d3 προνυμφική ηλικία οδήγησε σε παρεμπόδιση της προνυμφικής- προνυμφικής έκδυσης ενώ η αποσιώπηση του SnJHER στην L6d9 προνυμφική ηλικία οδήγησε σε παρεμπόδιση της προνυμφικής-νυμφικής και νυμφικής-ενήλικης έκδυσης. Επιπροσθέτως τα ενήλικα στα οποία είχε αποσιωποιηθεί το SnJHER παρουσίασαν δυσμορφίες στον σχηματισμό των πτερύγων τους. Ανάλυση με ημιποσοτικό PCR έδειξε πως η αποσιώπηση του SnJHER σχετίζεται με την μείωση των επιπέδων έκφρασης του EcR και του γονιδίου Hsc70, γεγονός που αποδεικνύει πως η SnJHER σχετίζεται με την υδρόλυση ενός JH ή ενός JH-like υποστρώματος, η συσσώρευση του οποίου παρεμποδίζει την διαδικασία της έκδυσης μέσω παρεμβολής του στην έκφραση του υποδοχέα των εκδυστεροειδών. Επίσης, η ετερόλογη έκφραση της πρωτεΐνης SnJHER σε κυτταρικές σειρές λεπιδοπτέρων εντόμων, έδειξε τον πιθανό συσχετισμό της στον καταβολισμό των χημικών αναλόγων των ορμονών νεότητας fenoxycarb και methoprene, ενώ η υπερέκφρασή της στην L5 προνυμφική ηλικία μέσω ανασυνδυασμένου βακουλοϊού οδήγησε σε επιτάχυνση της νύμφωσης. Τα γεγονότα αυτά, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι το SnJHER ανοίκει σε μια υπεροικογένεια πρόσφατα εξελιγμένων γονιδίων αποκάλυψε τον διττό μοριακό ρόλο του γονιδίου αυτού, με πιθανή πλαστικότητα στον καταβολισμό των υποστρωμάτων. Επιπροσθέτως στο S. nonagrioides, απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν λειτουργικά και μοριακά, οι μερικές αλληλουχίες των γονιδίων EcR (SnEcR) και USP (SnUSP). H λειτουργική ανάλυση έγινε είτε μέσω απευθείας ένεσης δίκλωνων μορίων RNA στην αιμολεμφική κοιλότητα των εντόμων, είτε μέσω εκτροφής των με ανασυνδυασμένα βακτήρια που συνέθεταν in vivo τα dsRNAs. Η αποσιώπηση του SnEcR στην L5d3 προνυμφική ηλικία οδήγησε στη δημιουργία δυσμορφιών στα μεταμερή του εντόμου, ενώ η αποσιώπηση του SnEcR στην L6d9 προνυμφική ηλικία οδήγησε σε παρεμπόδιση της προνυμφικής-νυμφικής έκδυσης καθώς και στην δημιουργία ενηλίκων με εμφανείς δυσλειτουργίες στις πτέρυγες και τις κεφαλές τους. Επιπλέον έγινε συγκριτική λειτουργική ανάλυση του γονιδίου του υποδοχέα των εκδυστεροειδών στο κολεόπτερο έντομο μοντέλο T. castaneum (TcEcR). Η αποσιώπηση του TcEcR οδήγησε σε καθυστέρηση της νύμφωσης καθώς και στην παρεμπόδιση της προνυμφικής-νυμφικής έκδυσης. Όσον αφορά το γονίδιο USP, η αποσιώπηση του SnUSP στην L5d3 προνυμφική ηλικία οδήγησε σε παρεμπόδιση της προνυμφικής-προνυμφικής έκδυσης, ενώ η αποσιώπηση του SnUSP στην L6d6 προνυμφική ηλικία οδήγησε σε καθυστέρηση της νύμφωσης. Τέλος διελευκάνθηκε ο μοριακός τρόπος δράσης του ξενοβιοτικού δισφαινόλη-A, ως ασθενής αγωνιστής των εκδυστεροειδών. Η πειραματική διαδικασία απέδειξε πως η δισφαινόλη-A λειτουργεί απ’ευθείας στα ρυθμιστικά στοιχεία των EcR/USP γεγονός που επεξηγεί αποκαλυπτικά τον λόγο για τον οποίο το ξενοβιοτικό αυτό συμμετέχει στην πλήρη αποδιοργάνωση της εκδυσιολογικής διαδικασίας του S. nonagrioides. Τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής ανέδειξαν τον καθολικό ρόλο των γονιδίων που κωδικοποιούν για τις συγγενικές εστεράσες των ορμονών νεότητας, του γονιδίου που κωδικοποιεί για τον υποδοχέα των εκδυστεροειδών και του γονιδίου που κωδικοποιεί για τον υποδοχέα USP στην ρύθμιση της προνυμφικής κυρίως αλλά και της ευρύτερης ανάπτυξης των εντόμων. Ο ρόλος τους σε γενικές γραμμές παραμένει ίδιος, δηλαδή τα γονίδια αυτά συμμετέχουν στην ενορχήστρωση της εκδυσιολογικής διαδικασίας, αλλά διαφέρει σημαντικά όσον αφορά την εξειδίκευσή τους στα εκάστοτε μοριακά μονοπάτια. Επιπλέον, το παράδειγμα της δισφαινόλης αποδεικνύει την στενή σχέση της ρύθμισης της ανάπτυξης των εντόμων από τον ανθρωπογενή παράγοντα. Σε πραγματικές συνθήκες, η προνυμφική αλλά και η γενικότερη ανάπτυξη των εντόμων δεν επηρεάζεται μόνο από την γονιδιακή ρύθμιση και από τον γενετικό προγραμματισμό per se, αλλά από πληθώρα ανθρωπογενών ή μη παραγόντων που παρεμβάλλονται στις μοριακές αλλά και στις ενδοκρινολογικές τους διαδικασίες.

Insect development is a complex mechanism which is regulated by several molecular, biochemical, hormonal and environmental factors. Juvenile hormone esterase (JHE), ecdysone receptor (EcR) and ultraspiracle (USP) genes are considered as the key molecular components of the developmental program in insects. In addition, several anthropogenic factors which are deposited in insect’s environment, act directly in their developmental core, with tremendous physiological consequences. The purpose of this work was to study the molecular mechanisms which are implicated in insect’s development. The lepidopteron Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae) and the coleopteron insect-model Tribolium castaneum (Coleoprera: Tenebrionidae), were used as experimental insects. In S. nonagrioides a family of JHE-related genes was molecularly characterized. Moreover, one particular member of this family, the SnJHER gene, was functionally and biochemically characterized. In order to functionally characterize SnJHER, several RNAi techniques were used with respect to the dsRNA delivery method (baculovirus or bacterial dsRNA administration/ direct dsRNA injection). The functional characterization revealed that SnJHER is implicated in larval-larval, larval-pupal, pupal-adult transition. In order to biochemically characterize SnJHER, the gene was heterologously expressed in lepidopteran cell lines using plasmid or baculovirus vectors. Additionally several biossays were performed in S. nonagrioides larvae with baculoviruses over-expressing SnJHER. The results, revealed the dual-role of SnJHER, in either the control of larval-larval molts or the JH-based pesticide detoxification. Moreover, the partial sequences of S. nonagrioides EcR (SnEcR) and USP genes (SnUSP) were cloned and characterized. Functional characterization of these genes by direct dsRNA injection, revealed their physiological implication in larval-larval molts of S. nonagrioides. In addition, a comparative functional analysis of Tribolium castaneum EcR gene was performed, while the molecular impact of bisphenol-A on the developmental programming of insects was also investigated. The findings of this work revealed the major role of JHE, EcR and USP genes in the control of larval development. Furthermore, this study shed light on the molecular mechanisms by which insect development is regulated by the abiotic environment.