Παραλλακτικότητα του γονιδίου DRB1 σε ελληνικές φυλές προβάτων και συσχετισμός των αλληλομορφών του με παρασιτολογικές και παραγωγικές παραμέτρους

Abstract

Το Μείζον Σύστημα Ιστοσυμβατότητας (MHC)είναι ένα σύμπλοκο γονιδίων με λειτουργικό ρόλο που, κυρίως, αφορά ανοσολογικές ιδιότητες. Το γονίδιο DRB1, το πιο πολυμορφικό γονίδιο του MHC, κωδικοποιεί τη β πολυπεπτιδική αλυσίδα του μορίου MHC της τάξεως ΙΙ και εδράζεται στην επιφάνεια των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων (APC). Τα APC παρουσιάζουν στα CD4+ Tλεμφοκύτταρα πεπτιδικά τμήματα αντιγόνων, προερχόμενα από εξωκυτταρικές πρωτεΐνες και παράσιτα, μέσω των μορίων MHC της τάξεως ΙΙ που διαθέτουν. Ο έντονος πολυμορφισμός του γονιδίου DRB1 εντοπίζεται κατά κύριο λόγο στο εξόνιο 2, το οποίο κωδικοποιεί τμήμα της περιοχής δέσμευσης του αντιγονικού πεπτιδίου (PBR)των μορίων MHC της τάξεως ΙΙ και ως εκ τούτου η παραλλακτικότητα του εξονίου 2 σχετίζεται άμεσα με την ανοσολογική απόκριση του οργανισμού. Έως τώρα δεν έχει μελετηθεί η παραλλακτικότητα του γονιδίου του προβάτου DRB1 (Ovar-DRB1) σε ελληνικές φυλές. Στη διεθνή Βάση Δεδομένων Ανοσοπολυμορφισμού για το Ovar-MHC (IPD-MHC Database EMBL-EBI), βρίσκονται καταχωρημένες 88 διαφορετικές νουκλεοτιδικές αλληλουχίες του εξονίου 2 του γονιδίου Ovar-DRB1 προβάτων από ξένες φυλές, κυρίως, εριοπαραγωγικής και κρεοπαραγωγικής κατεύθυνσης. Επιπλέον, στη βιβλιογραφία υπάρχουν δημοσιευμένες εργασίες στις οποίες αλληλόμορφα του γονιδίου Ovar-DRB1 σχετίζονται με την ανθεκτικότητα, κυρίως, σε νημάτωδα, καθώς και με διάφορες άλλες ιδιότητες που αφορούν σε παραγωγικά χαρακτηριστικά του προβάτου. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της παρουσίας αλληλομόρφων Ovar-DRB1 σε δύο ελληνικές φυλές προβάτων και ο συσχετισμός τους με την ανθεκτικότητα σε γαστρεντερικές παρασιτώσεις, καθώς και με χαρακτηριστικά της γαλακτοπαραγωγής τους. Συλλέχτηκαν δείγματα αίματος και κοπράνων από δύο ποίμνια αποτελούμενα από 232 πρόβατα Φριζάρτας και 203 Καλαρρύτικα, αντίστοιχα, ενώ λήφθηκαν και στοιχεία από τον έλεγχο των αποδόσεων των δύο ποιμνίων. Από κάθε δείγμα αίματος απομονώθηκε το γονιδιωματικό DNA για την ενίσχυση του εξονίου 2 του γονιδίου Ovar-DRB1, η οποία διεξήχθη με Touchdown PCR, ώστε να αποφευχθεί ο σχηματισμός μη ειδικών προϊόντων. Ακολούθησε η απευθείας αλληλούχηση των ενισχυμένων προϊόντων για την ταυτοποίηση των αλληλομόρφων. Η αλληλουχία του εξονίου 2 των νέων αλληλομόρφων επαληθεύτηκε με δεύτερη PCR, στην οποία χρησιμοποιήθηκε διαφορετικό ζεύγος εκκινητών και εν συνεχεία διενεργήθηκε κλωνοποίηση των προϊόντων της πριν την αλληλούχηση. Τα προϊόντα της δεύτερης PCR ενσωματώθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα pBlueScript SK, ο οποίος χρησιμοποιήθηκε για τον μετασχηματισμό των επιδεκτικών βακτηρίων E. coli του vii στελέχους JM109, σε καλλιέργεια. Tα νέα αλληλόμορφα εντοπίστηκαν στις μετασχηματισμένες βακτηριακές αποικίες με τη βοήθεια της διεξαγωγής της Colony PCR, τα προϊόντα της οποίας υπέστησαν πέψη με το ένζυμο περιορισμού RsaI. Από τις αποικίες αυτές απομονώθηκαν οι πλασμιδιακοί φορείς στους οποίους διεξήχθη η αλληλούχηση του ενθέματός τους, επιβεβαιώνοντας την αλληλουχία του εξονίου 2 των νέων αλληλομόρφων. Ο έλεγχος των παρασιτολογικών παραμέτρων διενεργήθηκε με την κοπρανολογική καταμέτρηση των αναπαραγωγικών στοιχείων των γαστρεντερικών παρασίτων (Faecal Egg Counting, FEC) και με τον προσδιορισμό των επιπέδων του πεψινογόνου με την τροποποιημένη μέθοδο Hirschowitz στο πλάσμα του αίματος. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, ταυτοποιήθηκαν συνολικά 39 αλληλόμορφα Ovar-DRB1, εκ των οποίων 10 αναφέρονται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία, ενώ καταμετρήθηκαν 134 διαφορετικοί γονότυποι. Καταγράφηκε υψηλό ποσοστό ετεροζυγωτίας, 84,49%, γεγονός το οποίο θεωρείται φυσιολογικό για το γονίδιο Ovar-DRB1. Μόνον 15 στους 134 γονότυπους ήταν κοινοί και στις δύο φυλές, ενώ στο 54% των γονότυπων των Καλαρρύτικων και στο 23% των γονότυπων των προβάτων Φριζάρτας ταυτοποιήθηκαν νέα αλληλόμορφα. Στην Καλαρρύτικη φυλή παρατηρήθηκε σημαντικό έλλειμμα ετεροζυγωτών γονότυπων. Το μεγαλύτερο ποσοστό ζώων με υψηλό παρασιτικό φορτίο και με υψηλά επίπεδα πεψινογόνου στο πλάσμα εντοπίστηκε στην Καλαρρύτικη φυλή. Αν και στις δύο φυλές βρέθηκαν ωοκύστες κοκκιδίων (Eimeria spp)και στρογγυλοειδή αυγά νηματωδών (strongyles), αυγά του κεστώδους Moniezia expansa και του νηματώδους Nematodirus filicollis ανιχνεύθηκαν μόνο στα Καλαρρύτικα, ενώ μόνο στα πρόβατα Φριζάρτας βρέθηκαν αυγά του νηματώδους Capillaria spp. Επίσης, στο 22,6% των Καλαρρύτικων προβάτων βρέθηκαν περισσότερα του ενός είδους αναπαραγωγικά στοιχεία στο ίδιο ζώο, σε αντίθεση με το 1,6% των προβάτων Φριζάρτας. Στην Καλαρρύτικη φυλή, τα αλληλόμορφα της ομάδας G σχετίζονταν σημαντικά με χαμηλές τιμές FEC, ενώ της ομάδας Κ εμφάνισαν ασθενή συσχέτιση με υψηλές τιμές FEC. Επίσης, παρατηρήθηκε ασθενή συσχέτιση των αλληλομόρφων της ομάδας Ι με χαμηλές τιμές mI.U. τυροσίνης. Στη φυλή Φριζάρτας, τα αλληλόμορφα της ομάδας Κ σχετίζονταν σημαντικά με χαμηλές τιμές mI.U. τυροσίνης. Επίσης, τα αλληλόμορφα της ομάδας Κ είχαν σημαντική επίδραση στην ποσοστιαία συγκέντρωση των ολικών στερεών, στην πρωτεϊνοπεριεκτικότητα, στη λιποπεριεκτικότητα και στη συγκέντρωση λακτόζης, ενώ τα αλληλόμορφα της ομάδας Ε επιδρούσαν σημαντικά στη συγκέντρωση της λακτόζης. Η επίδραση των αλληλομόρφων της ομάδας Κ ήταν σημαντική. Στην Καλαρρύτικη φυλή επιδρούσαν στις τιμές FEC, ενώ στη φυλή Φριζάρτας στις τιμές mI.U. τυροσίνης και σε συστατικά του γάλακτος. Η προσβολή από γαστρεντερικά παράσιτα δεν επέδρασε σημαντικά στα γαλακτοπαραγωγικά χαρακτηριστικά των προβατίνων της φυλής Φριζάρτας, ενώ στις προβατίνες της Καλαρρύτικης φυλής σχετιζόταν σημαντικά με χαμηλή πρωτεϊνοπεριεκτικότητα και με χαμηλά επίπεδα στερεού υπολείμματος άνευ λίπους, αλλά και με αυξημένη γαλακτοπαραγωγή (υπεραντιστάθμιση), υποδηλώνοντας την εξαιρετικά μεγάλη ανθεκτικότητα και προσαρμοστικότητα της φυλής.

The Major Histocompatibility Complex (MHC) is a gene cluster with functional role, mainly concerning immunological properties. The DRB1 gene, the most polymorphic gene of the MHC, encodes the beta chain of the MHC class II molecule and is located on the surface of antigen-presenting cells (APC). APCs present antigen peptide fragments to CD4+ T-lymphocytes, deriving from extracellular proteins and parasites, complexed with MHC class II molecules on their surfaces. The intense DRB1 gene polymorphism is localized primarily in exon 2, which encodes a portion of the peptide binding region (PBR) of MHC class II molecules and therefore, the variability of exon 2 is directly related to the organism’s immune response. So far no studies have investigated the variability of the sheep’s gene DRB1 (Ovar-DRB1) in Greek breeds. In the international Immuno-Polymorphism Database for Ovar-MHC (IPD-MHC Database EMBL-EBI), are currently registered 88 different nucleotide sequences of exon 2 of the Ovar-DRB1 gene from foreign sheep breeds used mainly for wool and meat production. Moreover, in literature there are published studies in which Ovar-DRB1 alleles are associated with resistance, particularly to nematodes, as well as with various other properties concerning production traits in sheep. The purpose of this study was to investigate the presence of Ovar-DRB1 alleles in two Greek sheep breeds and their association with resistance to gastrointestinal parasitosis, as well as with dairy characteristics. Blood and fecal samples were collected from two flocks with 232 sheep of the Frizarta breed and with 203 of the Kalarrytiko breed, while performance data have been collected regarding both flocks. Genomic DNA has been isolated from each blood sample in order to amplify exon 2 of the Ovar-DRB1 gene, using Touchdown PCR, to avoid the formation of non specific products. Direct sequencing of the amplified products was conducted afterwards for the identification of the alleles. The sequence of exon 2 of the new alleles was verified by a second PCR, in which a different pair of primers was used and subsequently cloning of the products was conducted before sequencing. The products of the second PCR were integrated into the plasmid vector pBlueScript SK, which was used for the transformation of competent E. coli bacteria of the strain JM109, in culture. The new alleles were detected in the transformed bacterial colonies using the Colony PCR, whose products were digested with the restriction enzyme RsaI. From these colonies plasmid vectors were isolated and sequencing of their inserts was conducted, confirming the sequence of exon 2 of the new alleles. Evaluation of parasitological parameters was effected through faecal counting of the reproductive elements of the gastrointestinal parasites (Faecal Egg Counting, ix FEC) and through determination of the levels of pepsinogen by the modified Hirschowitz method in blood plasma. According to the results, a total of 39 Ovar-DRB1 alleles were identified, 10 of which are reported for the first time in literature, while 134 different genotypes were counted. A high heterozygosity rate was recorded, 84.49%, which is considered normal for the Ovar-DRB1 gene. Only 15 out of 134 genotypes were common in both breeds, while new alleles were identified in 54% of the genotypes of Kalarrytiko and in 23% of the genotypes of Frizarta sheep. In Kalarrytiko breed a significant deficit of heterozygous genotypes was observed. The largest percentage of animals with a high parasitic load and high pepsinogen levels in plasma was detected in the Kalarrytiko breed. Although in both breeds coccidia oocysts (Eimeria spp) and strongyles were found, cestode Moniezia expansa and nematode Nematodirus filicollis eggs were detected only in Kalarrytiko, while nematode Capillaria spp eggs were found only in Frizarta sheep. Also, in 22.6% of Kalarrytiko sheep more than one type of reproduction elements were found in the same animal, in contrast to 1.6% of Frizarta sheep. In Kalarrytiko breed, the G group alleles were significantly associated with low FEC values, while K group alleles showed weak correlation with high FEC values. We also observed a weak correlation of I group alleles with low mI.U. tyrosine values. In Frizarta breed, K group alleles were significantly associated with low mI.U. tyrosine values. Also, the K group alleles had a significant effect on the percentage of total solids concentration, the protein content, the fat content and the lactose concentration, while the E group alleles had a significant effect on the lactose concentration. The impact of the K group alleles was significant. In Kalarrytiko breed, they had an effect on the FEC values, while in Frizarta breed they had an effect on the mI.U. tyrosine values and milk constituents. Infestation of gastrointestinal parasites did not affect significantly the milk production characteristics of the Frizarta breed ewes, while in Kalarrytiko breed ewes they were significantly associated with low protein content and low solids-not-fat levels, but also with increased milk production (overcompensation), indicating the extremely high tolerance and adaptability of the breed.