Κρυσταλλογραφική μελέτη δομής και λειτουργίας των κυκλοφιλινών και μελέτη εγκλεισμού φυσικών προϊόντων σε κυκλοδεξτρίνες

Abstract

Στη διατριβή αυτή, παρουσιάζεται η κρυσταλλογραφική ανάλυση με ακτίνες-Χ μεγάλων και μικρο-μεσαίων βιομορίων και συμπλόκων τους. Στο πρώτο μέρος, παρουσιάζεται η κρυσταλλογραφική μελέτη της δομής του ενζύμου της κυτταροπλασματικής κυκλοφιλίνης-Α από το αζωτοβακτήριο Azotobacter vinelandii (AvCyPA ή AvPPIB). Οι κυκλοφιλίνες ανήκουν σε μια κατηγορία ισομερασών προλίνης (PPIases), που καταλύουν την cis-trans ισομερίωση των πεπτιδικών δεσμών που προηγούνται του κατάλοιπου της προλίνης σε πρωτεϊνικά υποστρώματα. Πέρα από την ισομερίωση, η οποία επιταχύνει την αναδίπλωση των πρωτεϊνών, οι κυκλοφιλίνες εμπλέκονται σε λειτουργίες όπως η ενδοκυτταρική μεταφορά πρωτεϊνών, η μεταγωγή σήματος, η διακίνηση πρωτεϊνών και η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Οι κυκλοφιλίνες είναι ένζυμα μεγάλου βιολογικού και φαρμακευτικού ενδιαφέροντος, αφού η πρόσδεση τους στην κυκλοσπορίνη-Α (CsA) μετριάζει τις ανοσοκατασταλτικές επιδράσεις, που προκαλούνται μετά από μεταμόσχευση οργάνων. Μια άλλη σημαντική δράση είναι η πρόσδεση της κυκλοφιλίνης στην CA πρωτεΐνη του ιού HIV-1, που διευκολύνει την αντιγραφή του ιού. Η επίλυση δομών κυκλοφιλίνης από ένα ευρύ φάσμα οργανισμών έχει δείξει πως η πρωτεΐνη υιοθετεί δομή β-βαρελιού αποτελούμενου από οκτώ αντιπαράλληλους β-κλώνους, που περιέχουν μια θέση πρόσδεσης πεπτιδίου και περιβάλλονται από βρόχους που χαρακτηρίζονται από υψηλή κινητικότητα. Δομές κυκλοφιλινών δεσμευμένες με πεπτίδια προλίνης στην cis- ή trans- μορφή τους παρέχουν στιγμιότυπα του ενζυμικού μηχανισμού. Η κρυσταλλική δομή του ενζύμου της AvCyPA προσδιορίστηκε σε διακριτότητα 2.2 Å, ενώ η κρυσταλλική δομή της σε σύμπλοκο με το συνθετικό τετραπεπτίδιο ηλεκτρύλο – Αλανίνη – Φαινυλαλανίνη – Προλίνη – Φαινυλαλανίνη – p – νιτροανιλίδιο (succinyl-Ala-Phe-Pro-Phe-p-nitroanilide, suc-AFPF-pNA) σε 2 Å. Η προλίνη του πεπτιδίου υιοθετεί την cis διαμόρφωση. Η σύγκριση μεταξύ της ελεύθερης και συμπλοκοποιημένης μορφής, καθώς και αντίστοιχων μορφών του ενζύμου από άλλες πηγές, παρέχουν επιπρόσθετες πληροφορίες σχετικά με την ποικιλομορφία της διαμόρφωσης του ενζύμου, τις επιδράσεις που προκαλεί η πρόσδεση του πεπτιδίου στην συνολική δομή και τις αλληλεπιδράσεις δομής και λειτουργίας του ενζύμου. Τέλος, σχεδιάστηκαν σημειακές μεταλλάξεις εκτός του ενεργού κέντρου του ενζύμου προκειμένου να μελετηθεί ο νέος τρόπος διευθέτησης των αμινοξέων του ενεργού κέντρου, που επέρχεται με την μετάλλαξη. Ωστόσο, τα μεταλλάγματα AvPPIBA84S, AvPPIBΑ84Τ και AvPPIBΜ49Α δεν βρέθηκε να παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές στην δράση ισομεράσης σε σχέση με την φυσική πρωτεΐνη. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής παρουσιάζεται η ανάλυση των προϊόντων εγκλεισμού των d- και l- εναντιομερών βορνεόλης σε α- και β- κυκλοδεξτρίνη με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ. Οι κυκλοδεξτρίνες (CDs) είναι κυκλικοί ολιγοσακχαρίτες αποτελούμενοι, κυρίως, από έξη, επτά και οκτώ μονάδες α-(1-4)-D γλυκοπυρανόζης (α- CD, β-CD και γ-CD, αντίστοιχα). Στην υδρόφοβη κοιλότητα που διαθέτουν μπορεί να εγκλειστεί το υδρόφοβο τμήμα ενός μεγάλου αριθμού μορίων (ξενιζόμενα μόρια), που διαθέτουν το κατάλληλο μέγεθος και σχήμα, δημιουργώντας με τον τρόπο αυτό μαζί με τις κυκλοδεξτρίνες (μόρια ξενιστές), προϊόντα εγκλεισμού. Τα ξενιζόμενα μόρια συγκρατούνται μέσα στην κοιλότητα των CDs με μη-ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις, όπως δεσμούς Η, van der Waals και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Ο εγκλεισμός τροποποιεί τις φυσικοχημικές ιδιότητες του ξενιζόμενου μορίου αφού αφενός βελτιώνει χαρακτηριστικά του όπως η υδατοδιαλυτότητα και συγχρόνως το προστατεύει από χημική αποδόμηση, οξείδωση, κ.α. Η βορνεόλη είναι ένα δικυκλικό μονοτερπένιο, που απαντάται στα αιθέρια έλαια μιας πληθώρας φαρμακευτικών φυτών και χρησιμοποιείται στην φαρμακευτική. Είναι μια πτητική χειρόμορφη αλκοόλη, που απαντάται σε δυο εναντιομερείς μορφές d- και l-. Τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες έχουν χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμού ρακεμικού μίγματος των δυο εναντιομερών. Οι κρυσταλλικές δομές των προϊόντων εγκλεισμού των d- και l- εναντιομερών βορνεόλης σε α- και β-CD επιλύθηκαν με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ σε διακριτότητα περίπου 1 Å. Η γεωμετρία εγκλεισμού είναι παρόμοια μεταξύ των συμπλόκων των εναντιομερών στον ίδιο ξενιστή. Συγκεκριμένα, τόσο στα σύμπλοκα της α-CD όσο και σε εκείνα της β-CD, οι ξενιστές σχηματίζουν διμερή τύπου κεφαλής-κεφαλής που διευθετούνται κρυσταλλικά με τύπο «σκακιέρας». Στην μοναδιαία κυψελίδα των συμπλόκων d-, l-/α-CD, ένα μόριο d- ή l-βορνεόλης εγκλείεται στο μεσοδιάστημα της κοιλότητας του διμερούς των α-CD (στοιχειομετρία ξενιστή:ξενιζόμενου 2:1) αποδιατεταγμένο σε δυο ή τρεις θέσεις. Στην περίπτωση των d- και l-/β-CD ένα ξενιζόμενο μόριο, έντονα αποδιατεταγμένο, βρίσκεται εγκλεισμένο στο μεσοδιάστημα της κοιλότητας του σχηματισμένου διμερούς («εσωτερικό»), ενώ δυο ακόμα ξενιζόμενα μόρια βρίσκονται στις πλευρές των πρωτοταγών υδροξυλομάδων του διμερούς («εξωτερικά») και σταθεροποιούνται με υδρογονικούς δεσμούς με μόρια νερού και με τα υδροξύλια ξενιστή γειτονικών διμερών (στοιχειομετρία ξενιστή:ξενιζόμενου 2:3). Από την σύγκριση των κρυσταλλογραφικών δομών αυτών των συμπλόκων προκύπτει ότι: i) το μόριο της d- ή l- βορνεόλης είναι λιγότερο αποδιατεταγμένο όταν εγκλείεται στην μικρότερη κοιλότητα των α-CD διμερών σε σχέση με αυτή των β-CD και ii) Η «εσωτερικά» εγκλεισμένη d- βορνεόλη σε α- ή β-CD διμερές εμφανίζει μικρότερη αποδιάταξη συγκριτικά με την αντίστοιχα εγκλεισμένη l-βορνεόλη. In this thesis the X-ray crystallographic analysis of large and medium-small size biomolecules and their complexes is presented. The first part consists of the crystal structure of the cytoplasmic cyclophilin-A from Azotobacter vinelandii (AvCyPA or AvPPIB). Cyclophilins belong to a class of peptidyl-prolyl isomerase enzymes (PPIases) which catalyze the cis-trans isomerization of peptide bonds preceding proline residues of protein substrates. In addition to the isomerization, which accelerates protein folding, cyclophilins are involved in intracellular protein transport, signal transduction, trafficking, and cell cycle regulation. Cyclophilins are of significant biomedical interest because binding of cyclophilin to cyclosporin A (CsA) mediates immunosuppressive effects that are medically utilized in the prevention of transplant rejection. Another important activity is the binding of cyclophilin to the HIV-1 CA protein that facilitates viral replication. Determination of cyclophilin structures from a broad range of organisms have shown that the protein adopts an eightstranded antiparallel β-barel structure containing a peptide binding site surrounded by mobile loops. Structures of cyclophilins bound to propyl-peptides in the cis- or transform provided snapshots of the enzymatic mechanism. The crystal structure of the cytoplasmic cyclophilin A from Azotobacter vinelandii (AvCyPA or AvPPIB) was determined at 2.2 Å resolution. In addition, the crystal structure of the enzyme complexed with the synthetic tetrapeptide succinyl-Ala- Phe-Pro-Phe-p-nitroanilide (suc-AFPF-pNA) was determined at 2.0 Å resolution and shows that the tetrapeptide proline adopts a cis-isomer conformation. Comparisons between the uncomplexed and complexed structures as well as with other CyPA structures provides additional insights about conformational variability, effects of peptide binding and structure-function relationships of this enzyme. Finally, we designed point mutants by changing aminoacids that are located outside from the active site of the enzyme in order to examine the influence of such a substitution on the overall dynamic structural network involved in catalysis. The AvPPIBA84S, AvPPIBA84T and AvPPIBM49A mutants showed little or no difference in PPIase activity in comparison with the native enzyme.The second part of this thesis deals with the crystal structures of the inclusion compounds of (d)- and (l)-borneol stereomers in α- and β-cyclodextrin by X-ray crystallography at 1 Å resolution. Cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides consisting of six, seven or eight α-(1-4)-linked D-glucopyranose residues, called respectively α-, β- or γ- CD. As they possess a hydrophobic cavity, the hydrophobic moieties of a wide variety of guest molecules, having suitable size and shape, may be included there and form inclusion compounds. The guest molecules are held inside the CD cavity by non-covalent interactions, such as hydrogen bonds, van der Waals or hydrophobic interactions. The encapsulation modifies the physico-chemical properties of the guests by increasing their solubility in water and resulting in an augmented protection against chemical degration, oxidation, etc. Borneol is a bicyclic monoterpene present in the essential oils of numerous medicinal plants used in pharmaceutical industry. It is a volatile chiral alcohol occurring in two enantiomeric forms the d and l. Modified cyclodextrins have been used for chiral recognition of the two enantiomeric forms. The crystal structures of the inclusion compounds of (d)- and (l)-borneol stereomers in α- and β-CD were determined by X-ray crystallography at about 1 Å resolution. The complexes of the borneol enantiomers with the same host molecule have the same inclusion geometry. The α- or β-CDs form head-to-head dimers arranged in a “chessboard” crystal packing mode. In the cases of the d- and l-/α-CD complexes, one guest molecule is accommodated within the formed interdimeric cavity (2:1 host:guest stoichiometry) disordered over two or three sites. On the other hand, in the cases of the dand l-/β-CD complexes, a highly disordered guest molecule is found located within the formed interdimeric cavity and two more guest molecules are found at the rims of the primary hydroxyls of the dimer (2:3 host:guest stoichiometry), participating in the crystal contacts by forming H-bonds with external water molecules and -OH groups of the β- CDs of the adjacent dimers. The results of this crystallographic analysis have shown that (i) the d- or lborneol molecule is found significantly less disordered within the α-CDs dimer cavity than the larger β-CDs dimer cavity indicating that the complexation of the borneol with α-CD is more stable compared to that with β-CD and (ii) the only differentiation observed between the structures of the complexes of the enantiomers with the same host CD is that the encapsulated d-borneol molecule in the α- or β-CD dimer is found significantly less disordered than the l-borneol in the corresponding complexes.