Απομόνωση, χαρακτηρισμός συστατικών αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών της Μεσογειακής χλωρίδας: μελέτη και αξιολόγηση της βιολογικής δραστικότητας

Abstract

Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη υδατικών και οργανικών εκχυλισμάτων από αρωματικά και φαρμακευτικά φυτά της μεσογειακής χλωρίδας. Ο στόχος ήταν η ταυτοποίηση των κύριων συστατικών τους και η αξιολόγηση της εν δυνάμει βιολογική τους δράσης. Μελετήθηκαν τα φυτά: δεντρολίβανο (Rosmarinus officinalis L.), δίκταμο (Origanum dictamnus L.), κρόκος Κοζάνης (Crocus sativus L.), μελισσόχορτο (Melissa officinalis L.), φασκόμηλο (Salvia officinalis L.) και χαμομήλι (Matricaria recutita L.). Η παραλαβή των υδατικών εκχυλισμάτων προσομοιάστηκε με τη συνήθη χρήση αυτών σε μορφή αφεψήματος (2 g σε 1 κούπα τσαγιού-200mL νερού θερμοκρασίας 85 C), ενώ επιπλέον μελετήθηκε και η εκχύλιση με νερό σε θερμοκρασία περιβάλλοντος με ή χωρίς τη βοήθεια λουτρό υπερήχων. Στη συνέχεια, έγινε εκχύλιση των παραπάνω εκχυλισμάτων με οργανικό διαλύτη προκειμένου να παραλάβουμε τα συστατικά εκείνα που προσδίδουν το άρωμα των αφεψημάτων και των υδατικών εκχυλισμάτων. Στα παραπάνω εκχυλίσματα προσδιορίστηκε το ολικό φαινολικό τους περιεχόμενο με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu, ενώ η εκτίμηση της αντιοξειδωτική δράσης έγινε με τις μεθόδους ABTS και DPPH. Η αντιβακτηριακή δράση αυτών εκτιμήθηκε με τη μέθοδο διάχυσης υπερκειμένου σε άγαρ (Well diffusion assayWDA)

έναντι 19 θετικών κατά Gram

και 5 αρνητικών κατά Gram βακτηρίων. Ακολούθως, η οργανική φάση αναλύθηκε με αέρια χρωματογραφία συνδυασμένη με φασματομετρία μαζών (GC/MS), ενώ έγινε ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των φαινολικών συστατικών των αφεψημάτων με υγρή χρωματογραφία συνδυασμένη με φασματομετρία μαζών (LC/ MS) και ανιχνευτή φωτοδιόδων (DAD). Τα αποτελέσματα αναδεικνύουν ότι τα παραπάνω εκχυλίσματα είναι πλούσια σε φαινολικά συστατικά με τις τιμές να κυμαίνονται μεταξύ 8,1 και 195,2 mg καφεϊκού οξέος/200 mL. Παρουσίασαν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση και με τις δυο μεθόδους, η οποία είχε θετική γραμμική συσχέτιση με το ολικό φαινολικό περιεχόμενο (r FOLIN-ABTS =0.979; r =0.971, p<0.01). Το μελισσόχορτο ήταν αυτό που παρουσίασε τη μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε φαινολικά συστατικά (195.2 mg καφεϊκού οξέος/200mL) και την αντιοξειδωτική ικανότητα (1321,7 μmol Trolox/mL FOLIN-DPPH o για ABTS and 1206,3 μmol Trolox/mL για DPPH) σε σχέση με τα άλλα φυτά και με όλους τους τρόπους παραλαβής. Η εκχύλιση με ζεστό νερό υπερείχε τόσο έναντι της εκχύλισης με νερό σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, όσο και όταν η τελευταία υποβοηθήθηκε με υπερήχους. Μόνο τα υδατικά εκχυλίσματα του μελισσόχορτου παρουσίασαν, και με τους τρεις τρόπους παρασκευής, αντιμικροβιακή δράση έναντι του στελέχους Clostridium sporogenes LMG 8421 T , ενώ δεν παρατηρήθηκε καμία παρεμπόδιση στην ανάπτυξη του στελέχους Clostridium sporogenes LMG 14743. Επειδή, η αντιοξειδωτική δράση των αφεψημάτων έχει συσχετιστεί με την περιεκτικότητα αυτών σε φαινολικά συστατικά, αυτά μελετήθηκαν με υγρή χρωματογραφία. Τα αφεψήματα ήταν πλούσια σε φαινολικά οξέα και φλαβονοειδή. Το ροσμαρινικό οξύ ήταν το συστατικό που βρέθηκε σε όλα τα φυτά της οικογένειας Lamiaceae. Την υψηλότερη περιεκτικότητα σε ροσμαρινικό οξύ την κατέχει το μελισσόχορτο (14.923,9 μg/g φ.υ.) και τη χαμηλότερη το δεντρολίβανο (86,2 μg/g φ.υ.). Η χρωματογραφική ανάλυση της οργανικής φάσης των αφεψημάτων αποτυπώνει ένα διαφορετικό προφιλ ουσιών σε σχέση με αυτό του αντίστοιχου αιθερίου ελαίου, όπου παρατηρείται μια απώλεια ή απουσία των πιο πτητικών ενώσεων και ιδιαίτερα των μονοτερπενικών υδρογονανθράκων, ενώ ενισχύεται η περιεκτικότητα τους σε οξυγονούχα τερπένια και πολικά συστατικά. Για την παραλαβή των οργανικών εκχυλισμάτων, έγινε διαδοχική εκχύλιση με διαλύτες διαφορετικής πολικότητας κατά σειρά: πετρελαϊκός αιθέρας, διαιθυλαιθέρας και μεθανόλη. Στα εκχυλίσματα προσδιορίστηκε το ολικό φαινολικό περιεχόμενο, η αντιοξειδωτική και αντιμικροβιακή ικανότητα. Ακολούθως έγινε ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των κύριων συστατικών. Η μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε ολικά φαινολικά συστατικά παρατηρήθηκε, όπως αναμενόταν, στα μεθανολικά εκχυλίσματα των φυτών, όπου η κατάταξη με φθίνουσα σειρά είναι μελισσόχορτο (64,3 mg γαλλικού οξέος/g φ.υ.), δεντρολίβανο (55,2 mg γαλλικού οξέος/g φ.υ.), δίκταμο (51,5 mg γαλλικού οξέος/g φ.υ.), φασκόμηλο (43,2 mg γαλλικού οξέος/g φ.υ.), χαμομήλι (49,9 mg γαλλικού οξέος/g φ.υ.) και κρόκος (26,9 mg γαλλικού οξέος/g φ.υ.). Αντίστοιχη σειρά κατάταξης παρατηρείται και στον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής ικανότητας. Στα εκχυλίσματα του πετρελαϊκού αιθέρα παραλαμβάνονται πτητικά συστατικά, τα οποία αποτελούν τα κύρια συστατικά του αντίστοιχου αιθέριου v

ελαίου. Στα εκχυλίσματα του διαιθυλαιθέρα ταυτοποιήθηκαν φαινολικά συστατικά, κυρίως άγλυκα μέρη των φλαβονοειδών και τερπενικά παράγωγα. Στα μεθανολικά εκχυλίσματα των φυτών της οικογένειας Lamiaceae, το ροσμαρινικό οξύ ήταν η κύρια ένωση. Ταυτοποιήθηκαν επίσης παράγωγα αυτού, κυρίως ισομερή σαλβιανολικού οξέος καθώς και φλαβονοειδή κυρίως σε μορφή γλυκοζιτών. Σε αντίθεση με τα υδατικά εκχυλίσματα, τα οργανικά εκχυλίσματα παρουσίασαν ισχυρή αντιμικροβιακή δράση έναντι των στελεχών που εξετάστηκαν. Σε όλες τις περιπτώσεις μικροοργανισμών-στόχων, τα εκχυλίσματα του διαιθυλαιθέρα παρουσίασαν την πιο αξιοσημείωτη δράση. Όσον αφορά τα εκχυλίσματα του πετρελαϊκού αιθέρα, αυτά του δίκταμου και του δεντρολίβανου, ακολουθούμενο από αυτό του φασκόμηλου παρουσιάζουν τη μεγαλύτερη αντιμικροβιακή δράση έναντι των θετικά κατά Gram βακτηρίων παθογόνων της στοματικής κοιλότητας και παθογόνων τροφίμων. Τα αντίστοιχα εκχυλίσματα του μελισσόχορτου, του χαμομηλιού και του κρόκου εμφάνισαν αρκετά μικρότερη δράση, ενώ σε κάποια στελέχη ήταν ανενεργά. Τα μεθανολικά εκχυλίσματα συγκριτικά με τα άλλα δυο οργανικά εκχυλίσματα εμφανίζουν μικρότερη παρεμποδιστική δράση. Τα αρνητικά κατά Gram βακτηρία ήταν πιο ανθεκτικά. Από την αξιολόγηση των παραπάνω αποτελεσμάτων, έγινε επιλογή ζευγών μικροοργανισμών-στόχων και εκχυλισμάτων και μελετήθηκε η αντιμικροβιακή τους δράση με τη μέθοδο έλεγχου της βακτηριοκτόνου δράσης (Killing assay-KA). Παράλληλα, χρησιμοποιήθηκε η φασματοσκοπία FT-IR για την ανίχνευση των αλλαγών στα δομικά συστατικά των κυττάρων των μικροοργανισμών-στόχων. Μελετώντας τις χαρακτηριστικές περιοχές του φάσματος καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η μεγαλύτερη διαφοροποίηση έγκειται σε μεταβολές της δομικής διευθέτησης των λιπιδίων της κυτταρικής μεμβράνης, στους πολυσακχαρίτες και στα φωσφορολιπίδια του κυτταρικού τοιχώματος

The aim of this thesis was to study aqueous and organic extracts of aromatic and medicinal plants of the Mediterranean flora. The main goal was to identify the major components and to evaluate their potential biological activity. The plants studied were rosemary (Rosmarinus officinalis L.), dittany (Origanum dictamnus L.), saffron (Crocus satvius L.), lemon balm (Melissa officianalis L.), sage (Salvia officianlis L.) and chamomile (Matricaria recutita L.). Aqueous extracts were prepared in beverage form (2 g in 1 cup tea-200mL of water at 85 C), additionally extractions with water in ambient temperature with or without the use of ultrasounds water bath, were studied. Then the above extracts were further extracted with organic solvent in order to receive those components responsible for the aroma of herbal extracts. The content of total phenolic compounds in plant extracts was determined by Folin–Ciocalteu method, while the antioxidant activity was estimated with ABTS and DPPH assay. Well diffusion assay (WDA) was used for the antimicrobial screening against 19 Gram positive and 5 Gram negative bacterial strains. GC-MS and LCDAD/MS analyses were carried out in order to indentify the major components.

The results indicate that the aqueous extracts were rich in phenolic compounds, values ranging from 8,1 to 195,2 mg caffeic acid/200mL, possessing also a remarkable antioxidant activity. A linear positive correlation was achieved between total phenolic content and antioxidant activity (r FOLIN-ABTS =0.979; r =0.971, p<0.01). Lemon balm showed the highest values in total phenolic content (195,2 mg caffeicacid/200mL) and antioxidant activity (1321,7 μmol Trolox/mL for ABTS and 1206,3 μmol Trolox/mL for DPPH) independently of the extraction process. Aqueous extracts exhibited no antimicrobial activity; expect the case of lemon balm aqueous extracts against Clostridium sporogenes LMG 8421 T vii

FOLIN-DPPH . The infusions were rich in phenolic acids and flavonoids. Rosmarinic acid was the compound found in all plants of the family Lamiaceae. The highest content posses lemon balm (14.923,9 μg/g plant) and the lowest rosemary (86,2 μg/g plant). The chromatographic analysis of the organic phase of herbal shows a different profile than that of the corresponding essential oil. The loss or absence of the most volatile o compounds and particularly monoterpene hydrocarbons and the enhancement in content of oxygenated terpenes and polar components is observed. Plants were subjected to sequential extraction with petroleum ether, diethyl ether and methanol. The total phenolic content, antioxidant and antimicrobial activity were determined in the organic extracts as above. Then the qualitative and quantitative determination of major components was followed. The higher content of total phenolic compounds was observed , as expected, in the methanolic extracts of plants, wherein the ranking in decreasing order is lemon balm (64,3 mg gallic acid/g plant) , rosemary (55,2 mg gallic acid /g plant) , dittany (51,5 mg gallic acid/g plant) , sage (43,2 mg gallic acid/g plant) , chamomile (49,9 mg gallic acid/g plant) and saffron (26,9 mg gallic acid/g plant). A similar ranking was observed in the determination of antioxidant activity. In petroleum ether extracts volatile constituents, which are the main components of the corresponding essential oil, ware indentified. The diethyl ether extracts were abundant in phenolic compounds, mainly aglycone flavonoids and terpene derivatives. In methanolic extracts of plants of the family Lamiaceae, the rosmarinic acid was the major component. Also its derivatives, mainly isomers of salvianolic acid were identified and flavonoids predominantly in glycoside form. In contrast to the aqueous extracts, organic ones showed strong antimicrobial activity against the strains tested. In all cases, diethyl ether extracts showed the most remarkable effect. As to the petroleum ether extracts, dittany, rosemary and sage, show greater antimicrobial activity against Gram positive pathogenic bacteria of the oral cavity and food pathogens. The relevant extracts of lemon balm, chamomile and saffron showed much smaller effect, while in some strains were inactive. The methanol extracts compared with the other two organic extracts exhibit less inhibition. Gram negative bacteria were more resistant. The antimicrobial activity of the above extracts was found to be due to the phenolic compounds. From the evaluation of these results, pairs of microorganisms-targets and extracts were selected and were then studied in killing assay studies. Further, the FTIR

spectroscopy was used in order to reveal changes in the structural components of the cells. Studying the functional regions of the spectrum, we concluded that the viii

greater changes was achieved regarding in the structural arrangement of the cell membrane lipids, polysaccharides and the phospholipids in the cell wall