Χρήση νανοσυστημάτων στην ανίχνευση μελών του γένους Leishmania

Abstract

Η λεϊσμανίωση είναι μια παρασιτική νόσος του σκύλου που αποτελεί σημαντικό πρόβλημα για τη δημόσια υγεία. Η έγκαιρη και ακριβής διάγνωση της ασθένειας είναι καθοριστικής σημασίας στην εφαρμογή στοχευμένης θεραπείας και μειώνει τον κίνδυνο μετάδοσης, συμβάλλοντας στον περιορισμό του αριθμού των κρουσμάτων και της γεωγραφικής εξάπλωσης. Η χρήση βιονανοσυστημάτων θα μπορούσε να συνεισφέρει σημαντικά στη διευκόλυνση της ανίχνευσης του συγκεκριμένου παθογόνου σε κλινικά δείγματα χωρίς τη χρήση εξειδικευμένων συσκευών υψηλού κόστους. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να αναπτυχθεί μια εύκολα εφαρμόσιμη, γρήγορη, ειδική και αξιόπιστη μέθοδος ανίχνευσης της Leishmania spp. χρησιμοποιώντας κβαντικά κοκκία σεληνιούχου καδμίου και νανοσωματίδια χρυσού. Αρχικά, έγινε συγκριτική αξιολόγηση τεσσάρων μεθόδων PCR για ανίχνευση της Leishmania spp. προκειμένου να επιλεχθεί η κατάλληλη περιοχή-στόχος του γενώματος της Leishmania που θα στόχευαν οι ολιγονουκλεοτιδικοί-ανιχνευτές και να αναδειχθεί μια επαρκής μέθοδος αναφοράς. Σχεδιάστηκαν στη συνέχεια 4 ολιγονουκλεοτιδικοί-ανιχνευτές που συνδέθηκαν με εμπορικά διαθέσιμα νανοσωματίδια χρυσού για την ανίχνευση του DNA της Leishmania. Για τον ίδιο σκοπό (ανίχνευση DNA της Leishmania) σχεδιάστηκαν δύο ολιγονουκλεοτιδικοί-ανιχνευτές, ένας για σύνδεση με κβαντικά κοκκία και ο άλλος για σύνδεση με μαγνητικά σφαιρίδια. Για την ανίχνευση ενός επιφανειακού αντιγόνου της Leishmania, τα κβαντικά κοκκία και τα μαγνητικά σφαιρίδια συνδέθηκαν με δύο ειδικά για το παράσιτο αντισώματα. Η αξιολόγηση των υπό μελέτη μεθόδων έγινε αναφορικά με την ευαισθησία τους, την ειδικότητά τους, το ελάχιστο όριο ανίχνευσής τους (Ε.Ο.Α.), και ειδικά για τις μεθόδους PCR, την επαναληψιμότητα και την αναπαραγωγιμότητά τους. Το υλικό αναφοράς που χρησιμοποιήθηκε συνίστατο από στελέχη απομονωμένα σε καλλιέργεια και κλινικά δείγματα που συλλέχθηκαν από σκύλους που είχαν προσκομιστεί σε κτηνιατρικές κλινικές με υποψία λεϊσμανίωσης. Με όλες τις μεθόδους PCR που εξετάστηκαν καταγράφηκαν παρόμοια αποτελέσματα κυρίως αναφορικά με τα καλλιεργημένα στελέχη. Το υψηλότερο ποσοστό θετικών δειγμάτων ανιχνεύτηκε με τη μέθοδο Γ (58.1%). Με τις άλλες τρεις μεθόδους PCR, το ποσοστό θετικότητας ήταν σημαντικά χαμηλότερο και κυμάνθηκε σε όλες τις περιπτώσεις μεταξύ 19 και 25%. Η σχετική ευαισθησία και ειδικότητα εκτιμήθηκε αναφορικά με τη μέθοδο Γ, με την οποία ανιχνεύτηκε το υψηλότερο ποσοστό επιβεβαιωμένων θετικών και αρνητικών αποτελεσμάτων. Έτσι για τις μεθόδους Α, Β, και Δ, η ευαισθησία και ειδικότητα διαμορφώθηκε αντίστοιχα στο 50.7% (33/65), 43% (28/65), 40% (26/65) και 90.8% (69/76), 93.4% (71/76) 89.5% (68/76). Το μέσο ελάχιστο όριο ανίχνευσης των μεθόδων Α-Δ σε επτά επαναλήψεις υπολογίστηκε αντίστοιχα στα 30.7, 5, 3.7, και 5 προμαστιγωτά/ml. Η επαναληψιμότητα ήταν εξαιρετική για όλες τις μεθόδους αφού ήταν υψηλότερη από 0.75, κάτι που ήταν στατιστικά σημαντικό σε επίπεδο 5%, ενώ η αναπαραγωγιμότητα ήταν καλή έως εξαιρετική ανάλογα με τα αντιδραστήρια PCR που χρησιμοποιήθηκαν. Οι θετικοί και οι αρνητικοί μάρτυρες ανιχνεύτηκαν σωστά και με τους τρεις συνδυασμούς νανοσωματιδίων. Η σχετική ευαισθησία και ειδικότητα της μεθόδου ανίχνευσης DNA με τα νανοσωματίδια χρυσού συγκριτικά με τη μέθοδος αναφοράς, προσδιορίστηκε σε 92% και 100% αντίστοιχα αναλόγως του εξεταζόμενου υλικού, ενώ το Ε.Ο.Α., σε 11,5 ng/μl. Οι αντίστοιχες τιμές που καταγράφηκαν στο πλαίσιο του προσδιορισμού της ειδικότητας και της ευαισθησίας της μεθόδου ανίχνευσης DNA με χρήση κβαντικών κοκκίων ήταν 3,125 ng/μl, ενώ η ειδικότητα της μεθόδου ανίχνευσης των κυττάρων του πρωτοζώου με κβαντικά κοκκία ήταν 103 κύτταρα/ml. Οι τρεις μέθοδοι που περιγράφηκαν στην παρούσα μελέτη παρέχουν έναν εύκολο, γρήγορο και οικονομικό τρόπο για την ανίχνευση μελών του γένους Leishmania με τη χρήση των συγκεκριμένου τύπου νανο-ανιχνευτών. Οι προτεινόμενες μέθοδοι μπορεί να αποτελέσουν βάση για την ανάπτυξη διαγνωστικών μεθόδων ελέγχου για χρήση σε ενζωοτικές περιοχές ιδίως εάν λόγω διαθέσιμων πόρων δεν αποτελεί προτεραιότητα η ανίχνευση πολύ μικρής ποσότητας του παρασίτου.

Leishmaniosis is a parasitic zoonotic disease that represents a significant public health threat. The accurate diagnosis of the disease is of determinative importance in the application of targeted treatment and minimizes the danger of transmission contributing to the decrease of the number of cases and the limitation of their geographic distribution. The use of bio-nanoparticles could contribute significantly to the detection of the pathogen in clinical samples without the need of dedicated equipment. The aim of this study was the design of an easily applicable, fast, specific and reliable technique for the detection of Leishmania spp. using cadmium selenide (CdSe) quantum dots and gold nanoparticles. Initially, a comparative evaluation of four PCR methods was performed for the detection of Leishmania spp. in order to define the optimum target-DNA region of the Leishmania genome, and conclude to a reference methodology. Four (4) oligonucleotide-probes were designed to be conjugated with commercially available gold nanoparticles for the detection of Leishmania DNA. For the same reason (detection of Leishmania DNA) two oligonucleotide-probes were designed, the one to be conjugated with quantum dots and the other with magnetic beads. For the detection of surface antigen of Leishmania, quantum dots and magnetic beads were conjugated with two antibodies specific for parasite’s surface antigens. The evaluation of the methods under study was performed in regard to their sensitivity, specificity, minimum detection limit (MDL), and specifically for the PCR methods, repeatability and reproducibility. The reference material used consisted of cultured isolates and clinical samples that were collected from dogs brought to veterinary clinics with suspicion of leismaniosis. Similar results were recorded by all PCR methods with regard mainly to cultured isolates. The percentage of positive results recorded by method C was significantly higher compared to the other three (58.1%). The respective measurement for methods A, B, and D, was similar and varied in all cases between 19 and 25%. The relative sensitivity and specificity were referenced to method C that produced the highest percentage of confirmed positive and negative results. Effectively sensitivity and specificity of methods A, B, and D were defined to 50.7% (33/65), 43% (28/65), 40% (26/65) and 90.8% (69/76), 93.4% (71/76), 89.5% (68/76) respectively. The MDL of the methods A-D was calculated as the mean average of the measurement of seven repeats, at 30.7, 5, 3.7, and 5 promastigotes/ml, respectively. Repeatability was excellent for the all methods, as it was higher than 0.75, something that was statistically significant at 5% level. Reproducibility was good to excellent depending on the PCR reagents that were used. The positive and the negative controls were correctly identified with all three combinations of nanoparticles. The relative sensitivity and specificity of the DNA detection method with gold nanoparticles referenced to PCR, were 92% and100% respectively depending on the material to be examined, while the MDL was defined at 11,5ng/ml. The MDL of the DNA detection method using quantum dots was 3.125ng/ml, while the specificity of cellular detection method with quantum dots was 103 cells/ml. The three methods described in the present study provide an easy, fast and economic way for the detection of members of genus Leishmania using nano-probes. The proposed methods can be used for the development of diagnostic methods for use particularly in enzootic regions where detection of very small amounts of parasite is not of top priority.