Μελέτη θερμοεπαγωγής και βιολογικών ρολογιών στο έντομο Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae)

Abstract

Η πρόκληση της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να διακρίνει τη σχέση μεταξύ εσωτερικών και εξωτερικών μηνυμάτων, τα οποία συνδυαστικά οδηγούν τα έντομα σε διάπαυση στο έντομο Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae) Α. Η μελέτη των βιολογικών ρολογιών της S. nonagrioides 1. Τα βιολογικά ρολόγια της S. nonagrioides τα εξετάσαμε ως κιρκαδικά και ως φωτοπεριοδικά ρολόγια. Για να μελετήσουμε το μοριακό μηχανισμό του κιρκαδικού ρολογιού της S. nonagrioides, απομονώσαμε από κεφάλια προνυμφών της τα ωρολογιακά γονίδια per, tim, cyc και cry και στη συνέχεια μελετήσαμε την έκφραση τους με ημιποσοτικό PCR και ποσοτικό RT-PCR σε φωτοπερίοδο μεγάλης (16L:8D) και μικρής (10L:14D) ημέρας. Τα ωρολογιακά γονίδα Snοper, Snotim, Snοcry και SnοCyc στις χρονικές μελέτες σε S. nonagrioides προνύμφες, έδειξαν μια καθαρή κιρκαδική ταλάντωση και μια φωτοπεριοδική ανταπόκριση, Tα μοριακά αποτελέσματα των πειραμάτων μας δείχνουν ότι η αλλαγή φωτοπεριόδου επηρεάζει άμεσa την mRNAέκφραση των ωρολογιακών γονιδίων. 2. Ο στόχος αυτού του μέρους εργασίας μας είναι η μελέτη της σχέσης ανάμεσα στις λειτουργίες του φωτοπεριοδικού και του κιρκαδικού ρολογιού, στο μεταγωγικό μονοπάτι των φωτοπεριοδικών μηνυμάτων για την εκδήλωση προαιρετικής διάπαυσης. Εφαρμόστηκε σειρά πειραμάτων διαφορετικών φωτοπεριόδων σε ημερήσιο κύκλο (24 ώρες), τριήμερο κύκλο (72 ώρες) και τετραήμερο κύκλο (96 ώρες). Σε συνθήκες LD10:14 (24 ώρες) εμφανίστηκε ένας καθαρά 24ωρος ρυθμός των Snοper, Snοtim, Snοcry και Snocycle mRNA επιπέδων. Στη φωτοπερίοδο LD10:62 (τριήμερος κύκλος) εμφανίστηκε μια ταλάντωση των τεσσάρων γονιδίων και είδαμε μια κορυφή για όλα τα γονίδια, στο τέλος της σκοτόφασης. Σε συνθήκες L10:14D: 10L: 62D (τετραήμερος κύκλος) εμφανίστηκε μια ταλάντωση των mRNA επιπέδων των γονιδίων Η έρευνα μας σε σχέση με τη φωτοπεριοδική διάπαυση της S. nonagrioides δίνει ενδείξεις ότι το κιρκάδιο σύστημα είναι μέρος του φωτοπεριοδικού συστήματος. Τα δύο συστήματα βασίζονται σε μοριακούς ωρολογιακούς μηχανισμούς των γονιδίων του κιρκαδικού ρολογιού. Β. Μελέτη θερμοεπαγωγής στο έντομο S. nonagrioides Για τη μελέτη της θερμοεπαγωγής στο έντομο S. nonagrioides, απομονώσαμε, αναλύσαμε και μελετήσαμε την έκφραση σε συνθήκες μεγάλης και μικρής ημέρας (σε κρύο ή ζέστη) για τα heat shοck γονίδια: SnoHsp19.5, SnoHsp20.8, SnoHsc70, SnoHsp70 και SnoHsp83. Τα αποτελέσματα μας προτείνουν ότι τα γονίδια SnoHsp19.5 και SnoHsp20.8 ίσως παίζουν διακριτούς ρόλους στη διαδικασία της ρύθμισης της διάπαυσης. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι το γονίδιο SnoHsc70 ίσως παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια ειδικών σταδίων της διάπαυσης. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι το γονίδιο SnoHsp83 μπορεί να εμπλέκεται στην αναπτυξιακή διαδικασία η οποία διενεργείται ανάμεσα σε δύο εκδύσεις.

The objective of this thesis was to determine the relationship between internal and external messages, which combined lead insects in insect diapause in Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae) A. The study of biological clocks in S. nonagrioides. 1. Biological clocks of S. nonagrioides examined as the circadian and photoperiodic clocks. To study the molecular mechanism of the circadian clock of S. nonagrioides, we isolated from larval heads the clock genes per, tim, cyc and cry and then we studied their expression by semi-quantitative PCR and quantitative RT-PCR in long photoperiod (16L: 8D) and short (10L: 14D) day. The clock genes Snoper, Snotim, Snocry and SnoCyc showed a clear circadian oscillation and a photoperiodic response, The molecular results of our experiments show that changing photoperiod affects the mRNA expression of clock genes. 2. Goal of this part of our work is to study the relationship between the functions of the photoperioc and the circadian clock in the transport path of the photoperiodic message to the insect diapause. We performed a series of experiments at different photoperiods daily cycle (24 hours), three-day cycle (72 hours) and four-day cycle (96 hours). In conditions LD10:14 (24 Hours) a net 24 hour rate of Snoper, Snotim, Snocry and Snocycle mRNA levels was showed. In photoperiod LD10: 62 (three-day cycle) an oscillation of four genes and a peak for all the genes, the end of skotofasis was showed. In conditions L10: 14D: 10L: 62D (four-day cycle) an oscillation of the mRNA levels of genes was showed. Our research in relation to the photoperiodic diapause S. nonagrioides gives indications that the circadian system is part of photoperiodic system. The two systems are based on molecular clockwork of the circadian clock genes. B. The study of heat induction in insect S. nonagrioides In orde to study the heat induction in insect S. nonagrioides, we isolated, analyzed and studied the expression of the heat shock genes in conditions of long and short days (cold or hot): SnoHsp19.5, SnoHsp20.8, SnoHsc70, SnoHsp70 and SnoHsp83. Our results suggest that genes SnoHsp19.5 SnoHsp20.8 may play distinct roles in the process of regulation of diapause. Our results show that the gene SnoHsc70 probably plays an important role in the formation of protein during specific phases of diapause. Our results show that the gene SnoHsp83 may be involved in the development process carried out between two moult stages.