Ομοιόσταση του σιδήρου σε φυτά αραβοσίτου που αναπτύσσονται υπό συνθήκες έλλειψης θείου

Abstract

Η ομοιόσταση του θείου είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με την ομοιόσταση του σιδήρου, αφενός, επειδή πρωτεϊνικά συστήματα τόσο της φωτοσύνθεσης όσο και της αναπνευστικής αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων περιέχουν σύμπλοκα Fe-S και αφετέρου, επειδή ο αραβόσιτος, ως αγρωστώδες, ακολουθεί την στρατηγική ΙΙ για την απορρόφηση του Fe. Η στρατηγική αυτή περιλαμβάνει τη βιοσύνθεση φυτοσιδηροφόρων τα οποία θα συμπλοκοποιήσουν τον σίδηρο με σκοπό την μεταφορά του μέσα στο φυτό. Η πρόδρομη ένωση για τη βιοσύνθεση αυτή είναι ένα θειούχο αμινοξύ, η μεθειονίνη. Με την παρούσα εργασία μελετήσαμε την κατανομή του σιδήρου και την ανακατανομή του μέσα στο φυτό καθώς και τις μορφολογικές και ανατομικές αλλαγές που παρατηρούνται σε όλα τα φυτικά όργανα υπό συνθήκες έλλειψης θείου, προκειμένου να μελετήσουμε τις επιπτώσεις της μεταχείρισης στα αποθέματα αποπλασμικού σιδήρου. Για τη μελέτη αυτή φυτά αραβοσίτου αναπτύχθηκαν σε υδροπονική καλλιέργεια σε πειράματα μικρής (10 ημερών) και μεγάλης διάρκειας (26 ημερών). Τα φυτά αναπτύχθηκαν σε δύο διαφορετικά θρεπτικά υποστρώματα: σε πλήρες θρεπτικό διάλυμα και σε διάλυμα ελλειμματικό σε θειικά. Αρχικά εξετάστηκε η κινητική της συσσώρευσης και της συγκέντρωσης του σιδήρου, του θείου και των θειικών στο φυτό και η κατανομή τους στο υπέργειο μέρος και στο ριζικό σύστημα στο χρονικό διάστημα των 26 ημερών. Τα φυτά που αναπτύχθηκαν υπό συνθήκες έλλειψης θειικών χάνουν σίδηρο από τη ρίζα κατά το δεύτερο δεκαήμερο, συνεχίζουν να συσσωρεύουν ολικό θείο σε μικρές ποσότητες τόσο σε υπέργειο όσο και σε ριζικό καθ’ όλη την διάρκεια του πειραματικού και συνεχίζουν να αυξάνουν την ποσότητα θειικών σε μικρό ποσοστό στο υπέργειο όπου παραμένουν υπό την μορφή θειικών ιόντων. Η συσσώρευση του θείου στα φυτά της μεταχείρισης εξηγείται από το γεγονός ότι τα άλατα που χρησιμοποιήθηκαν ως πηγές θρεπτικών ιόντων, αν και αναλυτικής καθαρότητας, εντούτοις περιείχαν προσμίξεις θειικών, τα οποία απορροφήθηκαν από τα φυτά της μεταχείρισης. Στη συνέχεια, λαμβάνοντας υπόψη τη συνθετότητα της αρχιτεκτονικής του ριζικού συστήματος του αραβοσίτου σε συνδυασμό με τα παραπάνω ευρήματα μελετήθηκε η κινητική της κατανομής σιδήρου σε κάθε τύπο ρίζας υπό συνθήκες έλλειψης θειικών και το πως η τροφοπενία επηρέασε τον κάθε τύπο ρίζας από μορφομετική άποψη, εστιάζοντας στην 1η ομάδα βλαστογενών ριζών γιατί αυτός ο τύπος ριζών εκπτύσσεται κατά την ημέρα έναρξης της μεταχείρισης και αντιμετωπίζει από την αρχή την έλλειψη θειικών. Από τα αποτελέσματα αποκαλύφθηκε ότι τα τροφοπενικά φυτά συσσωρεύουν σίδηρο σε όλους τους τύπους ριζών κατά το πρώτο δεκαήμερο και εμφανίζουν απώλεια σιδήρου από όλους τους τύπους ριζών κατά το δεύτερο δεκαήμερο της έλλειψης θειικών. Από την ποσότητα ολικού θείου που αυξάνεται στη ρίζα, αυτή κατανέμεται κυρίως στο εμβρυακό ριζικό σύστημα, ενώ ανά μονάδα ξηρής μάζας το ολικό θείο συσσωρεύεται εξίσου σε όλους τους τύπους ριζών. Η ποσότητα θειικών αυξάνεται κατά το πρώτο δεκαήμερο σε όλους τους τύπους ριζών ενώ μειώνεται το δεύτερο δεκαήμερο και κατανέμεται εξίσου σε όλους τους τύπους ριζών. Η έλλειψη θειικών επηρέασε αρνητικά τη ξηρή μάζα των βλαστογενών ριζών. Υπήρξαν γραμμικές συσχετίσεις ανάμεσα στην ξηρή μάζα, στο οργανικό θείο και στον ολικό σίδηρο που επενδύθηκαν στους διάφορους τύπους ριζών, με έμφαση στο εμβρυακό ριζικό σύστημα, ιδιαιτέρως κατά το 1ο δεκαήμερο. Αντίθετα, κατά το 2ο δεκαήμερο ο σίδηρος μειώθηκε δραματικά και ομοιόμορφα σε όλους τους τύπους ρίζας εκτός από την πρωτογενή, στην οποία η μείωση υπολείπετο κατά 8%. Η αρχιτεκτονική του ριζικού συστήματος ενισχύθηκε σε διάφορα επίπεδα προκειμένου να αντιμετωπιστεί η σοβαρή έλλειψη θειϊκών. Αυτά περιελάμβαναν τροποποιήσεις στον αριθμό των ριζικών αξόνων των ομάδων ριζών, στο συνολικό μήκος τους, στην ξηρή μάζα που κατανεμήθηκε σε αυτές, στα τμήματα που έφεραν τις πλάγιες ρίζες, στον αριθμό και στο μήκος των πλαγίων ριζών, στη δημιουργία αερεγχύματος για να υποστηριχθούν από πλευράς θρέψης αυτές οι πλάγιες και στην ενίσχυση του αγγειακού συστήματος για αποτελεσματικότερη μεταφορά. Τα αποτελέσματα της ανίχνευσης και χαρτογράφησης των αποθέσεων σιδήρου στην επιφάνεια κάθε τύπου ρίζας έδειξαν ότι υπάρχουν αποθέσεις σιδήρου στην επιφάνεια της ρίζας, η κατανομή των αποθέσεων σιδήρου κατά μήκος του άξονα της ρίζας δεν είναι ομοιόμορφη, η κατανομή διαφέρει σε κάθε τύπο ρίζας και υπό συνθήκες έλλειψης θειικών περισσότερες αποθέσεις βρέθηκαν στο τμήμα της ρίζας που φέρει τις πλάγιες ρίζες. Η ξηρή μάζα των αποθέσεων μεταβάλλεται σε κάθε τύπο ρίζας κατά την διάρκεια του πειράματος και διαφοροποιείται από τον τύπο της ρίζας και από την τροφοπενία. Από την απεικόνιση της μεταβολής του pH στην επιφάνεια του ριζικού συστήματος η χρώση των διαφόρων τύπων ρίζας με το δείκτη pH bromocresol purple έδειξε ότι στις περισσότερες περιπτώσεις το τμήμα της ρίζας που ανιχνεύεται σίδηρος στην επιφάνεια του, έχει και μεγαλύτερο pΗ (pH>6). Η συγκέντρωση του συνολικού εκχυλίσιμου σιδήρου, του εξωτερικού (αποθέσεις σιδήρου) και στις περισσότερες περιπτώσεις του αποπλασμικού εκχυλίσιμου σιδήρου σε κάθε τύπο ρίζας των φυτών –S είναι μικρότερη από την αντίστοιχη των φυτών που αναπτύχθηκαν σε πλήρες θρεπτικό διάλυμα. Στα φυτά –S, η ποσότητα του εσωτερικού σιδήρου, που προκύπτει από τη διαφορά του εξωτερικού και του αποπλασμικού από τον ολικό σίδηρο, αυξάνεται σε κάθε τύπο ρίζας το πρώτο δεκαήμερο ενώ μειώνεται το δεύτερο δεκαήμερο από όλους τους τύπους ριζών. Ο εσωτερικός σίδηρος είναι περισσότερος από τον συνολικό εκχυλίσιμο σίδηρο (αποθέσεις και αποπλασμικός σίδηρος) στην πρωτογενή ρίζα στις δευτερογενείς ρίζες και στις ρίζες του μεσοκοτυλίου και λιγότερος στις βλαστογενείς ρίζες την 10η ημέρα της μεταχείρισης και είναι περισσότερος μόνο στην πρωτογενή ρίζα και λιγότερος στους άλλους τύπους ριζών την 19η ημέρα της μεταχείρισης. Η μελέτη των κατανομών των ποσοτήτων σιδήρου, ολικού θείου και θειικών του συστήματος σπόρος-μεσοκοτύλιο-κόμβος αποκάλυψε ότι, υπό συνθήκες έλλειψης θειικών, τα φυτά συσσωρεύουν ολικό σίδηρο στο σπόρο, στο μεσοκοτύλιο και τον κόμβο κατά το πρώτο δεκαήμερο, ενώ εμφανίζουν απώλεια σιδήρου κατά το δεύτερο δεκαήμερο της έλλειψης θειικών. Στο σπόρο μειώνεται η ποσότητα ολικού θείου και θειικών ενώ στο μεσοκοτύλιο και το κόμβο αυξάνεται παρά την έλλειψη θειικών. Η έλλειψη θειικών επηρέασε αρνητικά τη ξηρή μάζα και το φαινότυπο του σπόρου-μεσοκοτυλίου-κόμβου. Ως προς τα ανατομικά χαρακτηριστικά του μεσοκοτυλίου των φυτών -S, εντοπίστηκε αερέγχυμα σε τομές κοντά στο σπόρο, η επιφάνεια του οποίου αυξήθηκε κατά το δεύτερο δεκαήμερο και διαφοροποιήθηκε έναντι των φυτών-μαρτύρων καταλαμβάνοντας λιγότερη επιφάνεια αερεγχύματος την 17η ημέρα και περισσότερη την 26η ημέρα. Από τα αποτελέσματα των κατανομών των ποσοτήτων σιδήρου, ολικού θείου και θειικών του φυλλώματος διαπιστώνεται ότι υπό συνθήκες έλλειψης θειικών τα φυτά συνεχίζουν να συσσωρεύουν σίδηρο στα φύλλα κατά τη διάρκεια του πειράματος, με περισσότερο σίδηρο να συσσωρεύεται στα κατώτερα φύλλα. Τα φυτά –S συνεχίζουν να συσσωρεύουν ολικό θείο το πρώτο δεκαήμερο, ενώ μειώνεται η ποσότητα ολικού θείου το δεύτερο δεκαήμερο και συνεχίζει να συσσωρεύεται μόνο στο 4ο και 5ο φύλλο. Η ποσότητα ολικού θείου φαίνεται να κατανέμεται κυρίως στα ανώτερα φύλλα το πρώτο δεκαήμερο, ενώ ανά g ξηρής μάζας κατανέμεται σχεδόν εξίσου σε όλα τα φύλλα. Η ποσότητα θειικών αυξάνεται στα κατώτερα φύλλα το πρώτο και μειώνεται το δεύτερο δεκαήμερο. Ο ρυθμός διαπνοής των φυτών –S είναι μεγαλύτερος την 10η ημέρα της μεταχείρισης και μικρότερος την 19η ημέρα της μεταχείρισης σε σχέση με τα φυτά–μάρτυρες. Η ξηρή μάζα των ανώτερων φύλλων (ελασμάτων και κολεών) επηρεάζεται περισσότερο από την έλλειψη θειικών καθ’ όλη τη διάρκεια του πειράματος και το μήκος των ανώτερων φύλλων το δεύτερο δεκαήμερο. Η φυλλική επιφάνεια τόσο των ελασμάτων όσο και των κολεών των φυτών –S είναι μεγαλύτερη την 10η ημέρα της έλλειψης και μικρότερη την 19η ημέρα της έλλειψης σε σχέση με τα φυτά-μάρτυρες. Η συσχέτιση της ξηρής μάζας με την αντίστοιχη επιφάνεια των φύλλων έδειξε ότι το ίδιο ποσό ξηρής μάζας φύλλου αντιστοιχούσε σε υψηλότερη επιφάνεια στα φύλλα –S. Υπάρχει ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ της ποσότητας του οργανικού θείου που επενδύθηκε ανά φύλλο και της ειδικής επιφάνειας αυτού του φύλλου. Ένα από τα σημαντικά ευρήματα της παρούσας μελέτης είναι ο εντοπισμός αερεγχύματος στο έλασμα του 2ου φύλλου των φυτών –S, δεδομένου ότι μέχρι τώρα ο σχηματισμός αερεγχύματος υπό συνθήκες έλλειψης θρεπτικών στοιχείων έχει αναφερθεί μόνο σε βλαστογενείς ρίζες αραβοσίτου με τη λύση των κυττάρων του φλοιώδους παρεγχύματος. Το αερέγχυμα εμφανίστηκε κυρίως στο μέσο του ελάσματος του 2ου φύλλου των ελλειμματικών σε θειικά φυτών την 10η ημέρα και περιορίστηκε σημαντικά την 19η ημέρα. Την ημ10 διαπιστώθηκε ότι η έλλειψη θειικών για 10 ημέρες είχε ως αποτέλεσμα την δημιουργία αερεγχύματος στο έλασμα του 2ου φύλλου. Η ειδική επιφάνεια του ελάσματος του 2ου φύλλου των φυτών –S είναι μικρότερη σε σχέση με των φυτών μαρτύρων, ενώ ο ρυθμός διαπνοής του υπέργειου μέρους των φυτών –S είναι μεγαλύτερος συγκριτικά με τα φυτά μάρτυρες. Την ημ19 της μεταχείρισης διαπιστώθηκε ότι το ποσοστό αερεγχύματος ανά συνολική επιφάνεια τομής μειώνεται σε σχέση με το ποσοστό που μετρήθηκε την ημ10. Το ξηρό βάρος του ελάσματος του 2ου φύλλου στα φυτά –S είναι μεγαλύτερο συγκριτικά με τα φυτά μάρτυρες. Η ειδική επιφάνεια του ελάσματος του 2ου φύλλου στα φυτά –S δεν διαφέρει από εκείνη των φυτών μαρτύρων, ενώ ο ρυθμός διαπνοής του υπέργειου μέρους των φυτών –S είναι λιγότερος σε σχέση με τα φυτά μάρτυρες. Τα αποτελέσματα από την ανίχνευση του αποπλασμικού σιδήρου σε τομές που πραγματοποιήθηκαν στην 1η ομάδα βλαστογενών ριζών, στο μεσοκοτύλιο, το κόμβο, το έλασμα και το κολεό του 2ου φύλλου των φυτών –S έδειξαν ότι εντοπίζεται λιγότερος σίδηρος στους αποπλασμικούς χώρους την 10η ημέρα ενώ δεν παρατηρείται διαφορά την 19η ημέρα της μεταχείρισης σε σχέση με τα φυτά-μάρτυρες.

Sulfur homeostasis is closely related to that of iron, not only because important parts of photosynthesis machinery and respiration electron transfer chain include Fe-S clusters, but also because maize as a member of the Poaceae family utilizes the strategy II for iron uptake. This strategy includes phytosiderophores biosynthesis, which complex and transfer iron into the plant cells. The precursor for biosynthesis is a sulfur amino acid, methionine. Thus, with the present study we want to study the iron distribution and redistribution among the various organs as well as the morphological and anatomical changes that are addressed in all organs under sulfur deficiency. To this end, young maize plants were grown in hydroponic culture in short term experiments (10 days) and long term ones (26 days). Plants were grown in two different nutrient solutions: a full one and an sulfate depleted nutrient solution. It was firstly examined the kinetics of accumulation and concentration of iron, sulfur and sulfate in the plant and their distribution in shoot and root in a long term experiment. The S-deprived plants lose iron from the root during the second ten days, whilst they continue to accumulate total sulfur in both shoot and root and increase the amount of sulfate in small quantities in shoot, which it remains sulfate and is not reduced. In –S plants, the sulfur accumulation can be explained by the fact that salts used as sources of nutrient ions though analytical purity contained sulfate inpurities. Thereafter, taking into account both the complexity of the root system architecture and the findings which have been just mentioned above, the kinetics of iron distribution was studied in each root type and how the deficiency affect them morphometrically, focusing on the 1st group of crown roots because this root type faces the sulfate deprivation from the first day of its appearance. The results revealed that the sulfur-deprived plants accumulate iron in all root types during the first ten days, whereas they exhibit iron loss of all root types during the second ten days. The amount of the total sulfur increased in the root is mainly distributed to the embryonic root system whilst the total sulfur concentration is allocated equally in all root types. The amount of sulfate is increased in all root types during the first ten days and decreased the second ones. Sulfate deprivation negatively affects the dry mass of the 1st group of the crown roots. There were linear correlations among the dry mass, the reduced sulfur and total iron invested in the various root types, focusing on the embryonic root system, particularly during the first ten days. In contrast, iron was dramatically reduced in all root types except for the primary root in which the reduction fell short by 8% during the second ten days. The root system architecture was strengthened in various levels in order to address the serious sulfate deprivation. These included changes to the number of root axes, their total length, the dry mass allocated to them, the parts carrying the lateral roots, the number and length of the lateral roots, creation of the aerenchymatious area to support the lateral roots with nutrients and strengthen the vascular system for increased water and nutrients transport. The results of the detection and visualization of the iron depositions on the surface area of maize roots revealed that there were iron depositions onto the root surface, the allocation of the depositions along root axis was not uniform, the allocation differed in each root type, and the deprivation affected the allocation of iron depositions, which were mainly located in the root sector that carries lateral and emerging lateral roots. The dry mass of the depositions varies in each root type during the experiment, differs from the root type and the deficiency. The depiction of pH change along root axis with bromocresol purple, a pH indicator, showed that in most cases, the root sector which iron was detected has higher pH (pH>6). The concentration of the total extractable iron, the external iron (iron depositions) and in most cases of the apoplastic extractable iron in S-deprived plants are less compared with the control. In –S plants, the amount of the internal iron (the difference between total iron of the root and total extractable iron) is increased in each root type the first ten days whilst decreased the second ones. The internal iron is more than the total extractable iron (depositions and apoplastic iron) in the primary root, seminal roots and mesototyl roots and less in the nodal roots at day 10 under the deprivation. The internal iron is more than total extractable iron only in the primary root and less in other root types at day 19 under the deprivation. The study of iron, total sulfur and sulfate allocations in seed-mesocotyl-crown revealed that under sulfur deprivation plants accumulate iron to the seed, mesocotyl and crown at the first ten days, while exhibiting iron loss during the second ten days. The amount of the total sulfur and the sulfate is decreased to the seed and increased to the mesocotyl and crown. The dry mass and the phenotype of the mesocotyl and crown are adversely affected under sulfate deprivation. As for anatomical traits the results show the formation of the aerenchyma in mesocotyl cross sections which made near the seed of the S-deprived plants. The surface of the aerenchyma increased during the second ten days and differed from the control since it was less at day 17 and more at day 26. Corresponding distributions of iron, total sulfur and sulfate in leaves show that S-deprived plants continue to accumulate iron in all leaves during the experiment and it is distributed to the lower leaves. The S-deprived plants continue to accumulate total sulfur during the first ten days and reduce the amount of total sulfur in the second ten days, except for the 4th and 5th leaf that continue to accumulate total sulfur. On the one hand, the amount of the total sulphur seems to be distributed in the upper leaves the first ten days, on the other hand, the total sulphur concentration is allocated equally in all leaves. The amount of sulfate increased in lower leaves the first ten days and decreased the second ones. In –S plants, the transpiration rate of the shoot is more at day 10 under the deprivation and less at day 19 under the deprivation than control plants. The dry mass of the upper leaves (laminas and sheaths) affected more under sulfate deprivation during the experiment and the length of the upper leaves only during the second ten days. Moreover, the leaf surface of both lamina and sheath are larger at day 10 and smaller at day 19 under the deprivation compared with the control. In S-deprived plants, the correlation of the dry mass with the corresponding leaf surface showed that the same amount of the dry mass corresponded to greater leaf surface. Additionally, there is a strong positive correlation between the amount of reduced sulfur invested per leaf and the specific surface area of this leaf. Aerenchyma formation of the 2nd leaf lamina under sulfate deprivation is a finding which presented in this study, since aerenchyma formation under nutrient deficiencies and especially under nitrogen or phosphorus or sulfur deficiency has been reported only in the crown roots of maize by lysis of cortical cells so far. In S-deprived plants aerenchyma formation was found in the 2nd leaf. The lamina of this leaf showed enlarged gas spaces between the intermediate and small vascular bundles by lysis of mesophyll cells and to a greater extent on the d10 compared to d19. Aerenchymatous spaces were mainly distributed along the middle region of leaf axis. The sulfate deprivation for 10 days resulted in the formation of the aerenchyma on the lamina of the 2nd leaf. The lamina’s specific surface area was smaller compared to control plants and the transpiration rate of the shoot was more than control plants. At day 19 under sulfate deprivation the percentage of the aerenchyma per total surface section was decreased compared to the percentage estimated on the d10, the lamina’s dry mass was larger compared to control plants, the lamina’s specific surface area was as in control and the transpiration rate of the shoot was less than control plants. Last but not least, the results of the detection of apoplastic iron in cross sections made among the 1st group of the crown roots, the mesocotyl, the crown and lamina and sheath of the 2nd leaf revealed that less iron is located in the apoplastic space at d10 under the deprivation, whilst no differences regarding the colour intensity at d26 under the deprivation compared with the control.