Μελέτη RANKL επαγόμενων παθογενετικών μηχανισμών σε γενετικά ζωϊκά πρότυπα και νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις

Abstract

Η οστική ανακατασκευή είναι μια συνεχής διαδικασία ανανέωσης των μικρομονάδων των οστών με διαδοχική ενεργοποίηση και λειτουργία των οστεοκλαστών και οστεοβλαστών, κυττάρων υπεύθυνων για την οστική απορρόφηση και παραγωγή, αντίστοιχα. Φυσιολογικά και οι δύο διεργασίες βρίσκονται σε δυναμική ισορροπία μεταξύ τους, εξασφαλίζοντας την σκελετική ακεραιότητα. Η διατάραξη αυτής της ισορροπίας αποτελεί την κύρια αιτία πρόκλησης σκελετικών νοσημάτων, όπως η οστεοπόρωση. Η κυτταροκίνη RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor κΒ Ligand) μέλος της υπεροικογένειας του TNF (Tumor Necrosis Factor), αποτελεί τον κύριο διαμεσολαβητή στην διαδικασία της οστικής απορρόφησης καθώς επάγει την διαφοροποίηση, επιβίωση και ενεργοποίηση των οστεοκλαστών. Ως τριμερές συνδέεται στον υποδοχέα του RANK, επάγοντας τον τριμερισμό του και την ενεργοποίηση των ενδοκυτταρικών μονοπατιών που οδηγούν στην δημιουργία ώριμων και λειτουργικών οστεοκλαστών, ενώ η δράση του RANKL αναστέλλεται από την οστεοπροτεγερίνη (OPG), ένα ανταγωνιστικό διαλυτό υποδοχέα. Η αναλογία μεταξύ RANKL και OPG καθορίζει τη βιοδιαθεσιμότητα και τη δράση του RANKL στα βιολογικά συστήματα. Η σημασία του RANKL στην βιολογία του σκελετικού συστήματος φαίνεται από το γεγονός ότι μεταλλάξεις στο γονίδιο του RANKL προκαλούν αυτοσωμική υπολειπόμενη οστεοπέτρωση λόγω αδυναμίας σχηματισμού οστεοκλαστών. Αντιθέτως, αυξημένη παραγωγή του RANKL συνδέεται με επαγωγή οστεοκλαστικής δραστηριότητας και οστικής απώλειας σε ασθένειες όπως η οστεοπόρωση, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, το πολλαπλό μυέλωμα, οι οστικές μεταστάσεις και οι περιοδοντικές ασθένειες. Η αναστολή της δράσης του RANKL θεωρείται μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση για την παρεμπόδιση της οστικής απώλειας στις παραπάνω ασθένειες και έχει ήδη εγκριθεί η χορήγηση ενός μονοκλωνικού αντισώματος, του denosumab, έναντι του RANKL σε εμμηνοπαυσιακές οστεοπορωτικές γυναίκες. Το γεγονός αυτό καθιστά αναγκαία την εύρεση νέων αναστολέων του RANKL και την αξιολόγησή τους σε κατάλληλα ζωικά μοντέλα. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκαν δύο μοναδικά ζωικά μοντέλα που έχουν δημιουργηθεί από την ερευνητική ομάδα της Επίκ. Καθηγήτριας Ελένης Ντούνη. Το πρώτο γενετικό μοντέλο χαρακτηρίζεται από αυτοσωμική υπολειπόμενη οστεοπέτρωση και οφείλεται σε μια σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο RANKL του ποντικού που προκαλεί αντικατάσταση ενός αμινοξέος από γλυκίνη σε αργινίνη στην θέση 278, (G278R), καθιστώντας ανενεργή την πρωτεΐνη RANKL. Η μελέτη της υπεύθυνης μετάλλαξης έχει οδηγήσει στην κατανόηση του μοριακού παθογενετικού μηχανισμού και στον σχεδιασμό νέων αναστολέων έναντι του RANKL. Πιο συγκεκριμένα δείξαμε με πειράματα ανοσοαποτύπωσης και cross-linking ότι η μεταλλαγμένη RANKLG278R πρωτεΐνη δεν σχηματίζει ομοτριμερή και έχει απολέσει την βιολογική της δραστικότητα. Ακόμη σε ex vivo κυτταρικές δοκιμές δείξαμε ότι η RANKLG278R δεν επάγει τον σχηματισμό οστεοκλαστών ενώ ασκεί κυρίαρχη αρνητική επίδραση στην δράση της άγριου τύπου RANKL. Λόγω της υψηλής συντηρητικότητας που εμφανίζει η γλυκίνη στην θέση 278 μεταξύ των μελών της υπεροικογένειας του TNF, προχωρήσαμε σε βιοχημικό και λειτουργικό χαρακτηρισμό των πρωτεϊνών TNF και BAFF του ανθρώπου εισάγοντας την αντίστοιχη αμινοξική αλλαγή από γλυκίνη σε αργινίνη. Ομοίως, δείξαμε ότι οι μεταλλαγμένες TNFG122R και BAFFG249R πρωτεΐνες δεν σχηματίζουν τριμερή και δεν είναι βιολογικά ενεργές. Η αναγνώριση ενός τόσο κρίσιμου αμινοξέος που συμμετέχει ενεργά στον τριμερισμό των πρωτεϊνών της TNF υπεροικογένειας αποτελεί δυνητικά ένα σημαντικό φαρμακευτικό στόχο στην λογική σχεδιασμού νέων φαρμάκων για την αναστολή του τριμερισμού. Το μικρό μόριο SPD-304 έχει χαρακτηριστεί ως ένας αναστολέας του τριμερισμού του TNF ωστόσο η δραστικότητά του έναντι του RANKL δεν ήταν γνωστή. Δείξαμε ότι το SPD-304 αλληλεπιδρά με την RANKL πρωτεΐνη προκαλώντας αναστολή σε δοκιμές οστεοκλαστογένεσης. Όμως η υψηλή τοξικότητα του SPD-304 το καθιστά ακατάλληλο για φαρμακευτική χρήση. Έτσι, σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν συνολικά 72 ενώσεις ανάλογα του SPD-304 από τις οποίες ταυτοποιήσαμε 7 ενώσεις με τα εξής χαρακτηριστικά: 1) αποτελούν ισχυροί αναστολείς σε δοκιμές οστεοκλαστογένεσης, 2) παρουσιάζουν σημαντικά μικρότερη κυτταροτοξικότητα σε σχέση με το SPD304, και 3) παρουσιάζουν μεγάλη εξειδίκευση με την πρωτεΐνη-στόχο RANKL. Επίσης, βιοχημικός έλεγχος έδειξε ότι τα SPD-304 ανάλογα αποδιατάσσουν το τριμερές του RANKL. Επόμενος στόχος είναι η αξιολόγηση αυτών των αναστολέων του RANKL σε προκλινικό επίπεδο με τη χρήση κατάλληλων ζωικών μοντέλων οστεοπόρωσης. Πάνω σε αυτή την λογική, προχωρήσαμε στην δημιουργία και χαρακτηρισμό ενός καινοτόμου γενετικού μοντέλου οστεοπόρωσης με την υπερέκφραση του RANKL του ανθρώπου σε διαγονιδιακά ποντίκια. Χαρακτηρίσαμε 2 διαγονιδιακές σειρές, την Tg5516 που φέρει ένα αντίγραφο του διαγονίδιου και την Tg5519 με δέκα επιπλέον αντίγραφα. Ποσοτική ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του διαγονιδίου huRANKL έδειξε έκφραση στην Tg5516 σειρά και ακόμη υψηλότερα επίπεδα στην Tg5519 σειρά κυρίως σε οστά, σπλήνα και εγκέφαλο. Επίσης, η υπερέκφραση του huRANKL στις δύο διαγονιδιακές σειρές ακολουθεί το ίδιο πρότυπο έκφρασης με το ενδογενές γονίδιο (muRANKL). Ο φαινοτυπικός χαρακτηρισμός έδειξε ότι η Tg5516 σειρά αποτελεί ένα μοντέλο ήπιας οστεοπόρωσης με οστική απώλεια του σπογγώδους οστού, ενώ η Tg5519 σειρά εμφανίζει έντονη οστεοπόρωση με κύρια χαρακτηριστικά την πλήρη απώλεια του σπογγώδους οστού, πορώδη δομή στο φλοιώδες οστό, αυξημένη οστεοκλαστογένεση, σταδιακή καταστροφή της αυξητικής πλάκας και αυξημένη λιπογένεση στο μυελό των οστών. Τέλος, με την θεραπεία της οστεοπόρωσης στα Tg5519 ποντίκια έπειτα από χορήγηση του αντισώματος denosumab, διαπιστώσαμε ότι τα TgRANKL ποντίκια αποτελούν κατάλληλα μοντέλα οστεοπόρωσης για την αξιολόγηση νέων φαρμάκων, όπως των SPD-304 αναλόγων, σε προκλινικό επίπεδο.

Bone remodeling is a continuous process of renewal of the bone by sequential activation and function of osteoclasts and osteoblasts, cells responsible for bone resorption and production, respectively. Normally, both processes are in dynamic equilibrium with each other, ensuring the skeletal integrity. Disruption of this balance is the primary cause of skeletal diseases, such as osteoporosis. The cytokine RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor kB Ligand), a TNF superfamily member (Tumor Necrosis Factor), is the main mediator in the process of bone resorption as it induces differentiation, survival and activity of osteoclasts. As trimer RANKL binds to its receptor, RANK, induces trimerization and activation of intracellular pathways leading to the generation of mature and functional osteoclasts, while the action of RANKL is inhibited by osteoprotegerin (OPG), a soluble decoy receptor. The ratio between RANKL and OPG determines the availability and activity of RANKL in biological systems. The significance of RANKL in bone biology derives from the evidences that mutations in the RANKL gene lead to autosomal recessive osteopetrosis due to lack of osteoclasts. Conversely, increased production of RANKL is linked to excess osteoclast activity and bone loss diseases, such as osteoporosis, rheumatoid arthritis, multiple myeloma, bone metastases and periodontal diseases. The inhibition of RANKL is considered a promising therapeutic approach for the prevention of bone loss diseases and it has already been approved, through the administration of a monoclonal antibody against RANKL (denosumab), in postmenopausal osteoporosis, and in men with bone metastases derived from the prostate. This makes it necessary to find new inhibitors of RANKL and evaluate them in appropriate animal models. Within the present PhD Thesis we studied two new animal models which have been created by the research team of the Assistant Professor Eleni Douni. The first genetic model is characterized by autosomal recessive osteopetrosis due to a point mutation in the mouse RANKL gene that causes an amino acid substitution from glycine to arginine at position 278, (G278R) making the RANKL protein inactive (Douni et al. 2012). The study of the responsible mutation has led to the understanding of the molecular pathogenesis and design of new inhibitors against RANKL. In particular we showed by immunoblot experiments and cross-linking of RANKLG278R that the mutant protein does not form homotrimers and has lost its biological activity. In addition, the RANKLG278R does not induce osteoclast formation and exerts a dominant negative effect on the activity of wild type mouse RANKL. The amino acid glycine at position 278 shows high conservation among the members of the TNF superfamily. Βy introducing the corresponding amino acid change, from glycine to arginine, in human TNF and BAFF proteins, we have shown that the mutant TNFG122R and BAFFG249R proteins do not form trimers and are biologically inactive. The recognition of such an amino acid that is actively involved in the trimerization of the TNF superfamily members constitutes a potentially drug target for the rational design of new drugs that disrupt trimerization. The SPD-304 has been identified as small molecule inhibitor of TNF trimerization but its activity against RANKL was unknown. We showed that SPD-304 interacts with RANKL inducing osteoclastogenesis inhibition. However, the high toxicity of SPD-304 makes it unsuitable for pharmaceutical use. So, we designed and synthesized 72 new compounds depending on SPD-304 structure, 7 of which have been identified with the following characteristics: 1) inhibit RANKL-induced osteoclastogenesis, 2) exhibit considerably less cytotoxicity compared with the SPD-304, and 3) display high specificity to the target protein RANKL. Biochemical assays showed that such inhibitors disrupt the trimer formation of RANKL. The evaluation of these potent small molecule inhibitors of RANKL in preclinical level presupposes the use of appropriate animal models of osteoporosis. In this context, we developed and characterized novel genetic models of osteoporosis by overexpression of human RANKL in transgenic mice. We characterized two transgenic lines, the Tg5516 transgenic line that carries one copy of the transgene and the Tg5519 line with ten extra copies. Quantitative analysis of huRANKL gene showed expression in the Tg5516 mice with even higher levels in the Tg5519 mice mainly in bone, spleen and brain. Moreover, the overexpression of the huRANKL in both transgenic lines follows the same pattern of expression of the endogenous gene (muRANKL). Phenotypic characterization showed that the Tg5516 line represents a mild model of osteoporosis with bone loss of trabecular bone, while the Tg5519 line develops severe osteoporosis characterized by complete loss of trabecular bone, cortical porosity, increased osteoclastogenesis, progressive destruction of the growth plate and increased bone marrow adiposity. Finally, upon the effective therapy of osteoporosis in Tg5519 mice with denosumab, we concluded that the TgRANKL mice are appropriate models of osteoporosis for the preclinical evaluation of new drugs, such as the SPD-304 analogues.