Μηχανισμοί ανθεκτικότητας των ποικιλιών σκληρού σίτου Rusticano και Grazia σε συνθήκες αλατότητας και ψύχους

Abstract

Οι περιβαλλοντικές καταπονήσεις προκαλούν δυσμενείς συνθήκες για την ανάπτυξη των οργανισμών και διακρίνονται σε βιοτικές και αβιοτικές. Οι βιοτικές καταπονήσεις προκαλούνται από παθογόνα, παράσιτα, αρπακτικά, ενώ οι αβιοτικές προέρχονται από ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες. Η αλατότητα και οι χαμηλές θερμοκρασίες θεωρούνται από τους σημαντικότερους αβιοτικούς παράγοντες καταπόνησης των σιτηρών διότι παρεμποδίζουν την ανάπτυξη των φυτών και προκαλούν σοβαρές απώλειες στην γεωργική παραγωγή. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η ανάπτυξη των ποικιλιών σκληρού σίτου (Triticum turgidum var. durum), Rusticano και Grazia, που έχουν εμπορική σημασία για τη χώρα μας, σε συνθήκες αλατότητας (100, 200 mM ΝaCl) για 5 ημέρες και ψύχους (4oC) για 11 ημέρες. Στη συνέχεια, με τη χρήση υπερυψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας (UHPLC-MS) μελετήθηκε το μεταβολομικό πρότυπο του υπέργειου τμήματος των ποικιλιών μετά από 48 ώρες καταπόνησης των φυταρίων τους σε συνθήκες υψηλής αλατότητας (200 mM ΝaCl) και ψύχους (4oC). Βασιζόμενοι στα αποτελέσματα της μεταβολομικής ανάλυσης και μετά από αναζήτηση σε γνωστές βάσεις δεδομένων, εντοπίστηκαν τα γονίδια που πιθανά κωδικοποιούν για ένζυμα τα οποία εμπλέκονται στο μονοπάτι βιοσύνθεσης της προλίνης, και απομονώθηκαν οι cDNA κλώνοι των γονιδίων δ-OAT, P5CS1, P5CS2 and P5CR που κωδικοποιούν για τα ένζυμα αυτά στο σκληρό σιτάρι. Ακολούθως, μελετήθηκε η συσσώρευση των μεταγραφημάτων των γονιδίων σε συνθήκες αλατότητας (100 και 200 mM ΝaCl) και ψύχους (4oC) με τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real-Time PCR) καθώς και η συγκέντρωση της προλίνης στο ριζικό σύστημα και το υπέργειο τμήμα των ποικιλιών Rusticano και Grazia, μετά από 12, 24, 48 και 72 ώρες καταπόνησης. Από τις μετρήσεις των μορφολογικών παραμέτρων των φυταρίων σκληρού σίτου και των 2 ποικιλιών προέκυψε ότι η ποικιλία Rusticano είναι πιο ανθεκτική από την ποικιλία Grazia και στους 2 παράγοντες αβιοτικής καταπόνησης. Η μεταβολομική ανάλυση του υπέργειου τμήματος των ανωτέρω ποικιλιών, μετά από εφαρμογή αλατότητας και ψύχους, οδήγησε στην ταυτοποίηση είκοσι εννέα πρωτογενών (αμινοξέα, οργανικά οξέα, λιπίδια) και δευτερογενών μεταβολιτών (κυρίως αζωτούχες και φαινολικές ενώσεις). Σε σύγκριση με την ποικιλία Grazia, η ποικιλία Rusticano παρουσίασε ταχεία ενεργοποίηση του μεταβολισμού της στις συνθήκες καταπόνησης, διαφοροποίηση μεγαλύτερου αριθμού μεταβολιτών, καθώς και υψηλότερα επίπεδα συσσώρευσης μεταβολιτών (αμινοξέων, λιπιδίων, δευτερογενών μεταβολιτών) στο υπέργειο τμήμα της. Εξαίρεση αποτελεί, σε συνθήκες αλατότητας, η μεγαλύτερη συγκέντρωση της προλίνης στο υπέργειο τμήμα της ποικιλίας Grazia η οποία, λόγω μεγαλύτερης ευαισθησίας της σε αυτό τον παράγοντα καταπόνησης, συσσωρεύει το συγκεκριμένο μεταβολίτη προκειμένου να επέλθει οσμωρύθμιση και να συνεχιστούν οι μεταβολικές της διεργασίες. Aπό τη μεταγραφική μελέτη του μονοπατιού βιοσύνθεσης της προλίνης διαπιστώθηκε ότι σε συνθήκες αλατότητας η ανθεκτικότητα της ποικιλίας Rusticano έναντι της Grazia είναι εμφανής λόγω της μεγαλύτερης συσσώρευσης μεταγραφημάτων των γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεσής της καθώς και από τα υψηλότερα επίπεδα προλίνης στο ριζικό σύστημα και το υπέργειο τμήμα, μετά από 72 ώρες καταπόνησης. Σε συνθήκες ψύχους, η ανθεκτικότητα της ποικιλίας Rusticano έναντι της Grazia σχετίζεται με την έγκαιρη (μόλις 6 ώρες μετά την έκθεση των φυταρίων στους 4οC) συσσώρευση των μεταγραφημάτων των γονιδίων και τη μεγαλύτερη συσσώρευση της προλίνης στους ιστούς. Τα γονίδια TdP5CS1, TdP5CS2 και Tdδ-OAT είναι πιθανό να δρουν συνεργιστικά στη βιοσύνθεση της προλίνης από το γλουταμινικό οξύ και την ορνιθίνη αντίστοιχα, με το γονίδιο TdP5CS1 να έχει κυρίαρχο ρόλο στη συσσώρευση του μεταβολίτη και στις 2 συνθήκες καταπόνησης, ενώ από τα αποτελέσματα της μεταβολομικής ανάλυσης σε συνθήκες αλατότητας προκύπτει ότι η ορνιθίνη έχει ενεργό ρόλο και στα μεταβολικά μονοπάτια της αργινίνης και των πολυαμινών. Συμπερασματικά, τα φυτάρια της ποικιλίας Rusticano παρουσιάζουν καλύτερη προσαρμογή από τα αντίστοιχα της Grazia τόσο στην αλατότητα, όσο και το ψύχος.

Environmental stresses arise from conditions that are unfavorable for the optimal growth and development of plants and can be classified either as biotic or abiotic. Biotic stresses are caused by pathogens, parasites, predators and other competing organisms while abiotic are produced by inappropriate levels of physical components of the environment. Salinity and temperature extremes have serious effects on the physiology of cereal crops. Initialy, morphological parameters of two commercial durum wheat (Triticum turgidum var. durum) cultivars, Rusticano and Grazia, were studied and evaluated for their tolerance to salt and cold stress. Metabolomic analysis based on Ultra-high-pressure liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-TOF-MS) was employed to identify differentially regulated metabolites, 48 h after exposure of cvs Rusticano and Grazia to 200mM NaCl and 4oC. Based on the results of comparative analysis in Rusticano and Grazia cvs under salt and cold stress conditions, it was investigated the molecular regulation of proline biosynthesis after 12, 24, 48 and 72h under both stress conditions. In order to evaluate the relative importance of ornithine (Orn) and glutamate (Glu) as precursors in Pro synthesis, a partial cDNA encoding Orn-δ-aminotransferase (δ-OAT), two partial cDNAs encoding δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS1, P5CS2) and a partial cDNA encoding δ1-pyrroline-5-carboxylate reductase (P5CR) were isolated and sequenced from Triticum turgidum var. durum. In the initial screening experiments, it was shown that cv Rusticano exhibited larger root and shoot biomass than cv Grazia. Therefore, cv Rusticano is more tolerant than cv Grazia to salt and cold stress. Metabolomic analysis revealed the importance of twenty nine primary and secondary metabolites in the plants of both cvs subjected to salt and cold stress. In cv Rusticano more metabolites were induced than in cv Grazia, under both stresses and at higher levels than cv Grazia. The only exception was of the amino acid proline that its levels were higher in Grazia compared to Rusticano under salt stress. Real-Time PCR analysis revealed that the genes Tdδ-OAT, TdP5CS1, TdP5CS2 and TdP5CR that are implicated in proline biosynthesis are stress induced in roots and shoots of both cvs under both stress conditions. The expression of the genes was higher in the salt-tolerant cv Rusticano than in the salt-sensitive cv Grazia while the up-regulated expression of TdP5CS1 in roots and shoots was higher than that of TdP5CS2. It’s worth mentioning that the higher accumulation of proline in shoots of Grazia after 48 h of salt stress confirmed the results of metabolomic analysis, while cv Rusticano accumulated more proline later than Grazia (after 72 h of salt stress treatment). Under cold stress conditions, genes were over-expressed (with the exception of TdP5CR in shoots of both cvs), yet an earlier and higher response was observed in the cold-tolerant cv Rusticano, while proline accumulation showed a peak at 24 h in tissues (roots and shoots) of cv Rusticano, later than the peak of the genes’ expression. The experimental results indicate that glutamate pathway is dominant in salt stress induced proline accumulation, where TdP5CS1 seems to play more important role than does TdP5CS2. The associated work on metabolomics analysis reveals that ornithine seems to serve as a precursor of polyamine biosynthesis. The metabolite profiling and molecular regulation of proline biosynthesis show that cv Rusticano acclimate to both abiotic stresses better than Grazia.