Διερεύνηση μεθόδων in vitro πολλαπλασιασμού, της οικοφυσιολογίας του σπόρου και των φυλογενετικών σχέσεων των ειδών Arbutus της Ελλάδας

Abstract

Τα Arbutus andrachne, A. unedo και το φυσικό τους υβρίδιο A. x andrachnoides, είναι τα τρία είδη Arbutus που απαντώνται στην Ελληνική Χλωρίδα. Αποτελούν βασικά είδη της Μεσογειακής Μακίας, τα οποία λόγω των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών τους θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν ως καλλωπιστικά, στη διαμόρφωση του τοπίου αστικών και περιαστικών περιοχών, σε αναδασώσεις λόγω της εύκολης αναβλάστησης μετά από πυρκαγιά και στη φαρμακοβιομηχανία λόγω πολύτιμων ουσιών που περιέχονται στα φύλλα και στους καρπούς τους. Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε ο in vitro πολλαπλασιασμός και των τριών ειδών και αναπτύχθηκε για πρώτη φορά μια πλήρης μέθοδος για το μικροπολλαπλασιασμό των A. andrachne και Α. x andrachnoides ξεκινώντας από ενήλικα φυτά και σπορόφυτα. Έγινε εκτενής διερεύνηση ως προς την αποτελεσματικότητα διαφόρων κυτοκινινών στην παραγωγή βλαστών, καθώς περιοριστικός παράγων ήταν η επιμήκυνση των μικροβλαστών. H χρήση της ΖΕΑΤ καθώς και του 2IP επέφερε υψηλή παραγωγή και ικανοποιητική επιμήκυνση των μικροβλαστών και των τριών ειδών. Καλύτερη εποχή για την αρχική εγκατάσταση καλλιεργειών αποδείχθηκε η άνοιξη, με την καλλιέργεια εκφύτων κόμβων βλαστών τρέχουσας βλάστησης σε WPM με βιταμίνες Mullin και 2,5 mg l-1 ΖΕΑΤ και για τα τρία είδη Arbutus που μελετήθηκαν. Για το στάδιο του πολλαπλασιασμού των καλλιεργειών προτείνεται η χρήση 2,5 mg l-1 ΖΕΑΤ, που εμφάνισε μεγάλη αποτελεσματικότητα σε ότι αφορά στην παραγωγή βλαστών και στα τρία είδη, είτε σε WPM με βιταμίνες Mullin, είτε σε ΜS. Τα ίδια υποστρώματα ήταν κατάλληλα επίσης για τον μικροπολλαπλασιασμό και των τριών ειδών, με χρήση μητρικού υλικού από νεαρά σπορόφυτα. Η υποκαλλιέργεια σε θρεπτικό υπόστρωμα με 2,5 mg l-1 ΖΕΑΤ επαναλήφθηκε για μεγάλο αριθμό κύκλων (περισσότεροι από 14 δοκιμάστηκαν στην παρούσα μελέτη στο A. andrachne) με μεγάλη επιτυχία και για τα τρία είδη. Αντιμετωπίστηκαν επίσης με επιτυχία οι μολύνσεις κατά την αρχική καλλιέργεια, ενός παράγοντα περιοριστικού για την επιτυχή εγκατάσταση σε πολλά ξυλώδη είδη. Η ριζοβολία των μικροβλαστών έγινε σε πολύ υψηλά ποσοστά που άγγιζαν το 100% σε WPM με 1 mg l-1 IBA και για τα τρία είδη, ανεξάρτητα της ενήλικης ή νεανικής προέλευσης των μικροβλαστών. Ο εγκλιματισμός των φυταρίων σε ex vitro συνθήκες επίσης έγινε με πολύ υψηλό ποσοστό επιβίωσης καλοσχηματισμένων φυτών (90-100%). Διερευνήθηκαν επίσης για πρώτη φορά και προσδιορίστηκαν οι κριτικές τιμές της θερμοκρασίας για τη βλάστηση σπόρου των τριών ειδών. Η μέγιστη βλαστικότητα και για τα τρία είδη επιτεύχθηκε στους 15 οC και κυμάνθηκε από 87-99%. Οι 10 οC είναι κοντά στο κατώτατο όριο για βλάστηση των σπόρων και των τριών ειδών. Τα ανώτερα όρια θερμοκρασίας για βλάστηση των σπόρων A. andrachne και A. unedo κυμάνθηκαν από 20-25 οC, ενώ για το A. x andrachnoides ήταν 15-20 οC. Οι σπόροι, βλάστησαν εξ ίσου καλά σε φως ή σκοτάδι. Η βλαστικότητα των σπόρων που αποθηκεύτηκαν ξηροί στους 25 οC διατηρήθηκε και για τα τρία είδη σε υψηλά επίπεδα μετά από 11 μήνες αποθήκευση, περιορίζοντας όμως το εύρος της θερμοκρασίας για βλάστηση μεταξύ 10 και 15 οC. Μετά από 27 μήνες αποθήκευσης οι σπόροι δεν βλάστησαν. Η διερεύνηση των φυλογενετικών σχέσεων υπέδειξε για πρώτη φορά κατάλληλους μορφολογικούς (ποσοτικούς και ποιοτικούς) χαρακτήρες και μοριακούς δείκτες RAPDs για τη γενετική μελέτη του γένους που θεμελίωσαν σε γενετικό υπόβαθρο τη φαινοτυπική διαφορά του φυσικού υβριδίου. Τα προηγούμενα αποτελέσματα ενδυναμώνονται από τα αποτελέσματα του in vitro πολλαπλασιασμού και της οικοφυσιολογίας του σπόρου. Ενδιαφέρον έχει δε, ότι το μορφογενετικό δυναμικό και η συμπεριφορά του Α. x andrachnoides στον in vitro πολλαπλασιασμό κινήθηκε πλησιέστερα με αυτήν του Α. unedo, παρουσιάζοντας μεγαλύτερη ανταπόκριση σε σύγκριση με το A. andrachne, παρά τη φαινοτυπική του ομοιότητα με το τελευταίο.

Arbutus andrachne, A. unedo and their natural hybrid A. x andrachnoides are the three Arbutus species found in the Greek flora, representative of the Mediterranean maquis. Their particular characteristics could introduce them in the horticultural industry as ornamentals, for use in the urban and suburban landscape, for reforestation due to their ability to re-sprout easily after fire and to the pharmaceutical industry due to various precious substances in their leaves and fruits. The present thesis investigated the in vitro propagation of the above species and for the first time has developed a method of micropropagation for A. andrachne and Α. x andrachnoides from mature plants and young seedlings. A thorough investigation of the effectiveness of various cytokinin on shoot production was undertaken, as micro- shoot elongation was a limiting factor. The use of ΖΕΑΤ as well as 2IP resulted in high production and elongation of micro-shoots in all three species. The best season for the initial establishment of plants proved to be spring, with the cultivation of node explants from the current year’s shoots in WPM with Mullin vitamins and 2.5 mg l-1 ΖΕΑΤ for all three species of Arbutus studied. The use of 2.5 mg l-1 ΖΕΑΤ is proposed for the proliferation stage as it showed to be very effective in shoot production in all three species, either in WPM with Mullin vitamins or in ΜS. The same substrates were also suitable for the micropropagation of all three species using young seedlings as stock plant material. The subculture in nutrient medium with 2.5 mg l-1 ΖΕΑΤ could be repeated for a large number of cycles (more than 14 were tested in the current study for A. andrachne) with great success for all three species. Contamination, a limiting factor for the establishment of many woody species, was successfully treated during the initial cultivation. The rooting of microshoots reached very high levels that approximated 100% in WPM with 1 mg l-1 IBA for all three species, irrespective of the mature or young origin of the microshoots. The survival rate from the acclimatisation of plantlets to ex vitro conditions was very high with well-formed plants (90-100%). Furthermore for the first time the critical temperatures for seed germination of all three species was investigated and determined. Maximum germination for all three species was achieved at 15 οC and ranged between 87-99%. Temperature of 10 οC is near the lower threshold value for seed germination for all three species. The higher threshold temperature values for seed germination of A. andrachne and A. unedo ranged between 20-25 οC, whereas for the natural hybrid A. x andrachnoides temperatures ranged between 15-20 οC. Seeds germinated equally well under light and darkness. Seeds of all three species stored dry at 25 οC maintained their germination ability at high levels after eleven months of storage, limiting however the temperature range for germination between 10 and 15 οC. After storing for 27 months the seeds did not germinate. The investigation of phylogenetic relationships showed for the first time suitable morphological (quantitative and qualitative) characteristics and molecular markers RAPDs for the genetic study of the genus that developed the foundation at a genetic level for the phenotype variation of the natural hybrid. The latter results are strengthened by the seed ecophysiology and the in vitro propagation results. It is interesting that the morphogenetic potential and behaviour of Α. x andrachnoides under in vitro propagation progressed nearer to that of Α. unedo, showing a greater response than A. andrachne, despite the phenotypic similarity with the latter.