Ταυτοποίηση, ποσοτικός προσδιορισμός και εποχικές μεταβολές φαινολικών ενώσεων μεταξύ και εντός ποικιλιών ελιάς και μοριακή ταυτοποίηση - ιχνηλασία των προϊόντων ελιάς

Abstract

Για πολλούς αιώνες η ιστορία της ελιάς και των προϊόντων της είναι άρρηκτα δεμένη με την ιστορία της Ελλάδας. Τα προϊόντα της ελιάς, επιτραπέζιες ελιές και ελαιόλαδο, παίζουν σημαντικό κοινωνικοοικονομικό ρόλο στη χώρα μας. Η συνεχής απαίτηση του αγοραστικού κοινού τόσο για βελτίωση και διασφάλιση της ποιότητας των παραγόμενων προϊόντων της ελιάς όσο και για πιστοποίηση της προέλευσής τους, ειδικά όταν πρόκειται για προϊόντα ονομασίας προέλευσης (π.χ ελιές Καλαμών), έχει οδηγήσει στην ανάγκη ταυτοποίησης των διαφόρων ποικιλιών και ιχνηλασίας των προϊόντων τους. Επίσης, τα προϊόντα της ελιάς, αποτελούν αναπόσπαστο κομμάτι της Μεσογειακής δίαιτας, μιας δίαιτας με υψηλή περιεκτικότητα σε βιοενεργές ουσίες όπως βιταμίνες, φλαβονοειδή και πολυφαινόλες. Είναι γνωστό ότι οι φαινολικές ενώσεις αποτελούν συστατικά πολλών φυτών και έχουν προσελκύσει το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας καθώς προάγουν την υγεία των καταναλωτών κυρίως λόγω της αντιοξειδωτικής τους ικανότητας. Σκοπός του πρώτου μέρους της παρούσας εργασίας, ήταν ο διαχωρισμός δέκα ποικιλιών («Κορωνέικη», «Λιανολιά Κερκύρας», «Μαστοειδής», «Arbequina», «Αδραμυττινή», «Μεγαρείτικη», «Γαϊδουρελιά», «Καλαμών», «Κονσερβολιά», «Χαλκιδικής») και η μελέτη της ενδο – ποικιλιακής παραλλακτικότητας των τεσσάρων πιο διαδεδομένων στον Ελλαδικό χώρο ποικιλιών («Κορωνέικη», «Καλαμών», «Κονσερβολιά» και «Λ. Κερκύρας») με την χρήση SSR εκκινητών. Επίσης μελετήθηκε η ταυτοποίηση και η ιχνηλασία των προϊόντων των δέκα ποικιλιών ελιάς χρησιμοποιώντας νέα φύλλα, πράσινους και μαύρους καρπούς και εφαρμόζοντας δύο διαφορετικές μοριακές μεθόδους, εκείνες των δεικτών RAPDs και SSRs. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, η εφαρμογή της μεθόδου των μοριακών δεικτών SSR προκειμένου να διαχωριστούν οι δέκα προς μελέτη ποικιλίες κρίθηκε αποτελεσματική. Οι ποικιλίες διαχωρίστηκαν μεταξύ τους και ομαδοποιήθηκαν σε δύο ομάδες σύμφωνα με το μέγεθος του καρπού και την χρήση τους. Επίσης, οι εκκινητές SSR, ενδο-ποικιλιακά, ομαδοποίησαν τα ελαιόδεντρα της κάθε ποικιλίας δίνοντας πανομοιότυπα αλληλόμορφα προφίλ. Τέλος στην παρούσα μελέτη επιτεύχθηκε, για πρώτη φορά σε Ελληνικές ποικιλίες, η ταυτοποίηση πράσινων και μαύρων καρπών με την χρήση RAPD και SSR εκκινητών. Οι RAPD εκκινητές έδωσαν προϊόντα με παρόμοια πρότυπα ενώ οι SSR εκκινητές έδωσαν πανομοιότυπα πρότυπα αλληλομόρφων μεταξύ φύλλων και καρπών της ίδιας ποικιλίας. Και οι δύο μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην ταυτοποίηση και ιχνηλασία των καρπών της ελιάς, αλλά οι δείκτες SSR, που έδωσαν πανομοιότυπα πρότυπα κρίνονται πιο αξιόπιστοι. Στο δεύτερο μέρος της παρούσας μελέτης, οι ίδιες δέκα ποικιλίες ελιάς μελετήθηκαν ως προς την συγκέντρωση των συνολικών φαινολικών καθώς επίσης και ως προς την αντιοξειδωτική ικανότητα φύλλων και καρπών τους διαφορετικών εποχών και ετών. Επίσης, πραγματοποιήθηκε ταυτοποίηση και ποσοτικός προσδιορισμός των φαινολικών ουσιών. Η συγκέντρωση των ολικών φαινολικών εκφράστηκε σε mg ισοδύναμα γαλλικού οξέος (GAE) ανά gr νωπού φυτικού ιστού και η αντιοξειδωτική δράση εκφράστηκε σε ppm με τη μορφή του δείκτη IC50 (Inhibition Concentration) ο οποίος δηλώνει τη συγκέντρωση εκείνη του δείγματος που απαιτείται για να μειωθεί η αρχική συγκέντρωση του διαλύματος DPPH κατά 50%. Η ταυτοποίηση και η ποσοτικοποίηση των επιμέρους φαινολικών συστατικών πραγματοποιήθηκε με τη χρήση συστήματος υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης η συγκέντρωση των συνολικών φαινολικών διέφερε τόσο μεταξύ των ποικιλιών όσο και μεταξύ των ιστών ανά ποικιλία. Οι διαφορετικές ποικιλίες παρουσίασαν διαφορετική συγκέντρωση συνολικών φαινολικών αλλά παρόμοιο φαινολικό προφίλ. Και για τις δύο χρονιές, 2008 - 2009, οι περισσότερες ποικιλίες παρουσίασαν υψηλότερη συγκέντρωση συνολικών φαινολικών στα νέα φύλλα από ότι στους πράσινους και μαύρους καρπούς. Στα νέα φύλλα Απριλίου του 2008 η συγκέντρωση συνολικών φαινολικών κυμάνθηκε μεταξύ 10,1 - 20,6 mg GAE/g ν.φ.ι. ενώ στους πράσινους και μαύρους καρπούς του ιδίου έτους κυμάνθηκε μεταξύ 5,9 - 19,8 mg GAE/g ν.φ.ι. και 5,4 - 9,9 mg GAE/g ν.φ.ι. αντίστοιχα. Στα νέα φύλλα Απριλίου του 2009 η συγκέντρωση συνολικών φαινολικών κυμάνθηκε μεταξύ 12,5 - 18,7 mg GAE/g ν.φ.ι. ενώ στους πράσινους και μαύρους καρπούς κυμάνθηκε μεταξύ 4,1 - 13,9 mg GAE/g ν.φ.ι. και 5,6 - 10,1 mg GAE/g ν.φ.ι. αντίστοιχα. Τα νέα φύλλα Απριλίου του 2009 παρουσίασαν υψηλότερη συγκέντρωση συνολικών φαινολικών (12,5 - 18,7 mg GAE/g ν.φ.ι.) από τα φύλλα Σεπτεμβρίου (10,6 και 15,3 mg GAE/g ν.φ.ι.) – Δεκεμβρίου (10,3 και 17,0 mg GAE/g ν.φ.ι.) του ιδίου έτους. Συγκρίνοντας τις δύο χρονιές, 2008 – 2009, για τις περισσότερες ποικιλίες, τα νέα φύλλα Απριλίου του 2009 παρουσίασαν υψηλότερη συγκέντρωση συνολικών φαινολικών από τα νέα φύλλα Απριλίου του 2008 ενώ οι πράσινοι καρποί, για τις περισσότερες ποικιλίες, παρουσίασαν υψηλότερη συγκέντρωση συνολικών φαινολικών το 2008 από ότι το 2009. Βρέθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης των συνολικών φαινολικών και της αντιοξειδωτικής ικανότητας. Το φαινολικό προφίλ ήταν παρόμοιο μεταξύ των ποικιλιών διέφερε όμως ως προς τις συγκεντρώσεις της κάθε φαινολικής ουσίας. Oι κυριότερες φαινολικές ουσίες στα φύλλα ήταν η ελευρωπαΐνη, η ρουτίνη, ο 7-Ο-γλυκοζίτης της λουτεολίνης, ο 4-Ο-γλυκοζίτης της λουτεολίνης και ο 7-Ο-γλυκοζίτης της απιγενίνης, ενώ στους πράσινους και στους μαύρους καρπούς η ελευρωπαΐνη, η ρουτίνη, ο 7-Ο-γλυκοζίτης της λουτεολίνης και ο βερμπασκοζίτης.

Since the dawn of Hellenic history, olive tree and its products are present as a vital and essential socioeconomical element. The constant demand by the consumers not only for improving the quality of olive tree products but also for ascertaining their origin, particularly if these products have been defined as products of specific geographical origin (i.e. Kalamon Olives), has led to the necessity for identification of the different olive tree cultivars and traceability of their products. At the same time, olive products (olive oil and table olives) play a fundamental part to the Mediterranean diet, a diet with high content of bioactive substances such as vitamins, flavonoids and polyphenols. It is well known that phenolic compounds are constituents of many plants and they have attracted a great deal of public and scientific interest because of their health promoting effects as antioxidants. The purpose of the first part of this study was the identification of ten olive varieties (“Koroneiki”, “Lianolia Kerkyras”, “Mastoidis”, “Arbequina”, “Adramytini”, “Megaritiki”, “Gaidourelia”, “Kalamon”, “Konservolia’ and “Chalkidiki’) and the study of intra - varietal variability of the four most common varieties in Greece (“Koroneiki”, “Kalamata”, “Konservolia” and “L. Kerkyras”) using SSR primers. Furthermore, molecular markers originating from two different molecular techniques, RAPD and SSR, were used for the identification and traceability of the products of the ten varieties of olive using new season leaves, green and black drupes. According to the results, SSR molecular markers, effectively separated the varieties grouping according to the size of the fruit and their use. In the intra-varietal level, SSR markers, grouped the trees of each variety giving identical allelic profiles. Identification of green and black drupes using RAPD and SSR primers was performed for the first time for Greek varieties. The RAPD primers gave products with similar patterns while the SSR primers gave identical allelic patterns between leaves and drupes of the same variety. Both methods can be used for identification and traceability of the olive drupes, with SSR primers, being more reliable. In the second part of this study, the same ten olive varieties, were studied for total phenolic concentration, as well as for the antioxidant capacity of leaves and fruits of different seasons and years. Total phenolic concentration was expressed as milligrams of gallic acid equivalents (GAE) per gram of fresh tissue and the antioxidant activity was expressed through index IC50 (Inhibition Concentration, mg/l of extract) which indicates the extract concentration required to reduce the initial DPPH concentration by 50%. Separation and identification of phenolic compounds was carried out with an analytical HPLC system. According to the results, total phenolic concentration varied among varieties and among different tissues. Different varieties showed different total phenolic concentration but similar phenolic profile. For both years, 2008 - 2009, most varieties had a higher total phenolic concentration in young leaves than in green and black drupes. In the new leaves of April 2008, total phenolic concentration varied between 10,1 - 20,6 mg GAE / g F.W. while in the green and black drupes ranged between 5,9 - 19,8 mg GAE / g F.W. and 5,4 - 9,9 mg GAE / g F.W. respectively. In the new leaves of April 2009, total phenolic concentration varied between 12,5 - 18,7 mg GAE / g F.W. and in the green and black drupes ranged between 4,1 - 13,9 mg GAE / g F.W. and 5,6 - 10,1 mg GAE / g F.W. respectively. New leaves of April 2009 had a higher total phenolic concentration (12,5 - 18,7 mg GAE / g F.W.) than of September (10.6 and 15,3 mg GAE / g F.W.) and December (10.3 and 17,0 mg GAE / g F.W.). Comparing the two years (2008 – 2009), for most varieties, new leaves of April 2009 had a higher total phenolic concentration than the new leaves in April 2008 while green drupes, for most varieties, had a higher total phenolic concentration in 2008 than in 2009. A positive correlation was found between the concentration of total phenolics and antioxidant capacity. The phenolic profile was similar between varieties but the concentrations of each phenolic compound was different. The main phenolic compounds in the phenolic profile of leaves were oleuropein, rutin, 7-O-glycoside of louteolin, 4-O-glycoside of louteolin and 7-O-glycoside of apigenin, while in green and black drupes the main phenolic substances were oleuropein, rutin, 7-O-glycoside of louteolin and verbascoside.