Study of the production of lipids, polysaccharides and other metabolic compounds of biotechnological interest during growth of yeasts on low cost renewable substrates

Abstract

The present investigation focused on the potential of several yeast strains to synthesize metabolic compounds of importance for the Industrial Biotechnology. The metabolic compounds the study of which interested the current investigation were principally microbial lipids (called also single cell oils – SCOs), microbial mass and microbial intra-cellular polysaccharides and to lesser extent citric acid, mannitol and enzymes. The carbon sources used from the yeast strains were composed of hydrophilic materials of low (or even negative) value, whereas kinetic and physiological studies related with the microbial growth of the yeast strains were performed and discussed. In the first part of this study, it was desirable to study the potential of SCO and microbial mass production in some yeast strains growing in media containing glucose as sole carbon source. Firstly, a screening of 6 yeast strains (Rhodosporidium toruloides DSM 4444, Rhodotorula glutinis NRRL YB-252, Rhodosporidium toruloides NRRL Y-27012, Yarrowia lipolytica ACA YC 5033, Lipomyces starkeyi DSM 70296, Cryptococcus curvatus NRLL Y1511) growing on media containing an initial concentration of glucose (Glci) adjusted at c. 50 g/L under nitrogen-limited conditions in shake-flask experiments was performed. Thereafter, the most promising lipid-producing strain on media composed of glucose, namely Rhodosporidium toruloides DSM 4444, was cultivated in shake-flask and batch-bioreactor experiments in order to further demonstrate its capabilities towards SCO production. Initially, the effect of the addition of NaCl in several concentrations upon the production of biomass and SCO by the particular strain was investigated; batch-flask trials with increasing amounts of NaCl revealed the tolerance of the strain against NaCl content up to 6.0% (w/v). However, 4.0% (w/v) of NaCl was found to trigger oil accumulation for the particular strain, by enhancing lipid production yield up to 71.3% (w/w) per dry cell weight. The same amount of NaCl was employed in previously pasteurised batch-flask cultures in order to investigate the potential of performing the fermentation of SCO under non-aseptic conditions; indeed, the combination of NaCl and high glucose concentrations was found to result in very interesting SCO production Rhodosporidium toruloides cultures, with suppressed bacterial contamination of under these conditions having been observed. Aseptic batch-bioreactor trials of the yeast in the same media with high glucose content (up to 150 g/L) resulted in satisfactory substrate assimilation, with almost linear kinetic profile for lipid accumulation, regardless of the initial glucose concentration imposed. Finally, fed-batch bioreactor cultures led to the production of 37.2 g/L of biomass, accompanied by 64.5% (w/w) of lipid yield. After the successful growth and production of biomass and SCO by Rhodosporidium toruloides in glucose-based media containing significant initial quantities of NaCl, the next step was the application of growth of this microorganism on a salty wastewater supplemented with glucose. On the other hand, during the initial screening study on glucose, the employed strain Yarrowia lipolytica ACA YC 5033 had presented interesting production of citric acid, while literature suggested the potential of using strains of the species of Yarrowia lipolytica in salty media. Therefore, the second part in this chapter referred to the application of the ability of Rhodosporidium toruloides DSM 4444 and Yarrowia lipolytica ACA YC 5033 yeast strains to grow and produce useful compounds (SCO, yeast biomass, citric acid) in supplemented with glucose wastewaters contain high NaCl concentration like the table olive processing wastewaters (TOPWs), with the perspective of the (partial) replacement of tap water by this salty wastewater in fermentation processes. Therefore, Rhodosporidium toruloides DSM 4444 and Yarrowia lipolytica ACA YC 5033 were cultivated on TOPW-based media containing 3.0% (w/v) of NaCl enriched with several glucose concentrations (50, 100, 135 g/L) under different culture conditions. The maximum lipid content (9.3 g/L and 58.4% of lipid in dry cell weight – DCW) was achieved during the shake-flask fermentation of Rhodosporidium toruloides in nitrogen-limited TOPW-based media with 135 g/L of glucose. An increase up to 13.9 g/L and 73.9% w/w of lipid was achieved during the culture in 2-L bioreactor. Significant SCO production, comparable to the one achieved in aseptic cultures was equally performed in previously pasteurized media. In carbon-limited flask cultures, the highest biomass concentration achieved was 35.7 g/L, with biomass conversion yield per unit of sugar consumed (YX/Glc) being ≈0.36 g/g during cultivation of Rhodosporidium toroloides in TOPW-based media with glucose at 100 g/L. Furthermore, maximum biomass of 8.7 g/L with 14.3% w/w of lipid in DCW and citric acid produced up to 43.5 g/L (yield of citric acid per glucose consumed YCit/Glc=0.44 g/g) were observed during the flask fermentation of Yarrowia lipolitica in TOPW-based media with glucose at 100 g/L under nitrogen-limited conditions. In carbon-limited media of Yarrowia lipolytica growing in TOPW-based media supplemented with glucose, almost 30 g/L of DCW were produced with YX/Glc≈0.33 g/g. Lipid in DCW and citric acid produced during fermentation in 2-L fermentor were up to 32.9%, w/w and c. 68 g/L respectively, whereas similarly with the trials performed 2 with Rhodosporidium toruloides, the efficiency of Yarrowia lipolytica growing in TOPW-based media enriched with glucose under non-aseptic conditions was similar to the aseptic exoeriment. After the study of yeasts strain growing on substrates containing glucose as carbon source, in the next part of this thesid, we hav investigated the potential of biodiesel-derived waste glycerol conversion into metabolic compounds of added-value by yeast strains growing under nitrogen-limited conditions. After a first initial selection of yeast strains cultivated on biodiesel-derived waste glycerol utilized as carbon source under nitrogen-limited conditions (conditions that favor the accumulation of storage lipid by microorganisms) in flask experiments, two microbial species that presented the best performances on the production of lipid from crude glycerol, namely Lipomyces starkeyi (strain DSM 70296) and Rhodosporidium toruloides (strain NRRL Y-27012) were more profoundly studied concerning the above-mentioned aspect. Significant biomass and SCO production was reported even in cultures with high initial glycerol concentration (i.e. 180 g/L). Lipid quantities of c. 12 g/L (lipid in dry cell weight 35-40%), quite high values compared with the literature for oleaginous microorganisms growing on glycerol, were obtained for both Lipomyces starkeyi and Rhodosporidium toruloides. However, these strains presented presented different kinetic profiles regarding synthesis of intra-cellular polysaccharides (IPS). As far as Rhodosporidium toruloides was concerned, it has been seen that during the first growth phases of the microbial growth, and despite the nitrogen presence into the culture medium, significant quantities of intra-cellular polysaccharides were synthesized (at the first growth steps polysaccharides in DCW – YIPS/X≈40% w/w was observed). Thereafter, YIPS/X values were depleted while in absolute quantities (g/L), after the significant biosynthesis that had occurred at the first growth steps, c. 50 h after inoculation and until the end of the culture polysaccharides’ concentration remained practically constant, whereas simultaneously significant accumulation of storage lipids (rise of both absolute – g/L and relative values - % in DCW) was observed. On the other hand, Lipomyces starkeyi presented a different physiological profile since polysaccharides per unit of DCW remained practically constant with a value c. 30% w/w throughout the culture, while in absolute values (g/L), the concentration of polysaccharides constantly increased; Lipomyces starkeyi produced a significant quantity of polysaccharides of c. 7 g/L. Intra-cellular polysaccharides’ production from crude glycerol, has been rarely reported for microorganisms growing on glycerol. 3 Moreover, very scarce number of reports has indicated the production of SCO by Rhodosporidium toruloides and Lipomyces starkeyi growing on glycerol. In this part of the thesis, therefore, we report that these yeasts are able to efficiently convert raw glycerol into SCO, while Lipomyces starkeyi also synthesizes intra-cellular polysaccharides in remarkable quantities. In the last part of this investigation and after having performed experiments on glucose- or glycerol-based media, it was desirable to perform trials on media composed from either lactose or sucrose employed as the sole carbon source. The yeast species Yarrowia lipolytica, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis and Lipomyces starkeyi cannot easily consume either sucrose or lactose (or both of these carbon sources for wild strains of the species Yarrowia lipolytica). Therefore, in this last part of the investigation, the trials were performed exclusively with the strain Cryptococcus curvatus NRRL Y-1511, which has never previously been studied in relation with its potential of producing SCO and other metabolic compounds of biotechnological interest (e.g. intra-cellular polysaccharides, extra-cellular enzymes) during growth on these abundant carbon sources. When lactose or sucrose was employed as substrate under nitrogen-limited conditions, the yeast strain accumulated high quantities of IPS at the beginning of fermentation (up to 68% w/w), with IPS values progressively decreasing to 20%, w/w, at the end of the fermentation. Decrease in IPS content and consumption of extra-cellular lactose led to a subsequent rise in lipid accumulation, reaching 29.8% in dry cell weight (DCW) at 80 g/L of initial lactose concentration. Lactose was more favorable substrate for lipid production than sucrose. In nitrogen-excess conditions, IPS were produced in significant quantities despite the continuous presence of nitrogen into the medium. Growth on lactose was not followed by secretion of extra-cellular β-galactosidase. High quantities of extra-cellular invertase were observed during growth on sucrose. The composition of IPS was highly influenced by the sugar used as substrate. Cellular lipids contained mainly palmitic and to lesser extent linoleic and stearic acid. This part of the current thesis is the first report in the literature that demonstrates the interplay between the biosynthesis of intra-cellular total sugars and lipids synthesis for oleaginous yeast strains. The yeast strains tested in this study represent promising agents for the successful production of metabolic compounds of significance for the Industrial Biotechnology. In several cases, production of metabolic compounds (like lipid in citric acid) were comparable 4 with the higher ones achieved in the international literature, while growth in agro-industrial wastes not previously employed in the literature (like TOPW-enriched media) or in low-cost carbon sources utilized as substrates was performed, in some cases under non-aseptic conditions. Other metabolic compounds of importance rarely studied during growth of yeast strains, like like microbial intra-cellular polysaccharides, were produced and in some cases in significant quantities. 5

Η παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων (ΜΛ), κυτταρικής μάζας, ενδοκυτταρικών πολυσακχαριδίων καθώς και λοιπών βιοτεχνολογικών προϊόντων προστιθέμενης αξίας (π.χ. κιτρικού οξέος, ενζύμων, μαννιτόλης) κατά την αύξηση ζυμών σε υποστρώματα χαμηλού κόστους προσελκύει το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας τα τελευταίά χρόνια. Ειδικώς δε η δυνατότητα αξιοποίησης υδρόφιλων υποπροϊόντων και αποβλήτων προς την παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων τα οποία σε επόμενο στάδιο δύνανται να μετατραπούν σε «21? γενιάς» βιολογικό πετρέλαιο (βιοντήζελ) συνιστά βιοδιεργασία μέγιστης αιχμής.. Σε ένα πρώτο επίπεδο, στελέχη των ειδών Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Yarrowia lipolytica και Lipomyces starkeyi καλλιεργήθηκαν σε υποστρώματα με βάση τη γλυκόζη και σε συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο, εις τρόπον ώστε να κατευθυνθεί ο κυτταρικός μεταβολισμός προς τη σύνθεση λιπιδίων (ή και κιτρικού οξέος). Ο μικροοργανισμός Yarrowia lipolytica ACA YC 5033 παρήγαγε σε μη-αμελητέες ποσότητες κιτρικό οξύ, ενώ οι μικροοργανισμοί Rhodosporidium toruloides DSM 4444, Rhodotorula glutinis NRRL YB-252 και Rhodosporidium toruloides NRRL Y-27012 παρήγαγαν σχετικά ικανοποιητικές ποσότητες ΜΛ. Για το πιο ενδιαφέρον από τα προηγουμένως μελετημένα στελέχη, το στέλεχος Rhodosporidium toruloides DSM 4444, πραγματοποιήθηκε εκτενής μελέτη της αύξησης και παραγωγής λιπιδίων. Ο μικροοργανισμός αυτός καλλιεργήθηκε σε φιάλες και συσχετίστηκε η παραγωγή λιπιδίων από το μικροοργανισμό αυτό με την παρουσία NaCl στο περιβάλλον αύξησης. Με ιδιαίτερο ενδιαφέρον δείχτηκε ότι η αύξηση της συγκέντρωσης του NaCl στο περιβάλλον της αύξησης (μέχρι και της συγκέντρωσης του 6,0% κ.ο.) δεν επηρέασε αρνητικά την παραγωγή βιομάζας και ΜΛ από το μικροοργανισμό αυτό. Αντιθέτως, σε αρκετά αυξημένες αρχικές συγκεντρώσεις NaCl (π.χ. 6,0% κ.ο.) υπήρξε επαγωγή της παραγωγής ΜΛ. Τέτοιου είδους συσχέτιση παρουσίας NaCl και παραγωγής ΜΛ εμφανίζεται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία. Περαιτέρω, λόγω της αυξημένης παρουσίας του NaCl στο μέσο της αύξησης κατέστη δυνατή η παραγωγή ΜΛ υπό συνθήκες προηγούμενης παστερίωσης και όχι αποστείρωσης του θρεπτικού μέσου. Τέλος, ο μικροοργανισμός Rhodosporidimn toruloides DSM 4444 καλλιεργήθηκε σε βιοαντιδραστήρες ημισυνεχούς τροφοδοτούμενης λειτουργίας, παράγοντας 37,2 g/L βιομάζας που περιείχαν 64,5% κ. β. λιπίδια. Ως εφαρμογή της προηγούμενης διεργασίας χρησιμοποιήθηκαν ως υγρό ζύμωσης τα εμπλουτισμένα με γλυκόζη και πλούσια σε NaCl υγρά απόβλητα της διεργασία παραγωγής επιτραπέζιων ελιών (ΥΑΛΠΕΕ) προκειμένου μα μελετηθεί σε αυτά τα υποστρώματα η αύξηση και η παραγωγή λιπιδίων του μικροοργανισμού Rhodosporidiwn toruloides DSM 4444. Επίσης, δεδομένης της δυνατότητας στελεχών του μικροοργανισμού Yarrowia lipolytica να αυξάνονται σε υποστρώματα περιέχοντα NaCl και δεδομένης της δυναμικής του μικροοργανισμού Yarrowia lipolytica ACA YC 5033 να παράγει κιτρικό οξύ κατά την αύξηση του σε υποστρώματα με βάση τη γλυκόζη και σε συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο, όπως αυτή εδείχθη κατά το προηγούμενο στάδιο, πραγματοποιήθηκε η μελέτη της αύξησης και του μικροοργανισμού αυτού σε εμπλουτισμένα με γλυκόζη ΥΑΔΠΕΕ προκειμένου να παραχθεί κιτρικό οξύ από τα υλικά αυτά. Είναι η πρώτη φορά στη βιβλιογραφία που το ανωτέρω υπόστρωμα χρησιμοποιείται για την παραγωγή ΜΑ και κιτρικού οξέος. Τω όντι, αμφότεροι οι μικροοργανισμοί παρήγαγαν σε υψηλές ποσότητες τα επιζητούμενα μεταβολικά προϊόντα κατά την καλλιέργεια τους τόσο σε αναδευόμενες φιάλες όσο και σε εργαστηριακής κλίμακας βιοαντιδραστήρα. Οι μεγαλύτερες τιμές που επιτεύχθηκαν ήσαν για το μικροοργανισμό Rhodosporidium toruloides DSM 4444 18,8 g/L βιομάζας που περιείχαν 64,5% κ.β. λιπίδια ενώ για το μικροοργανισμό Yarrowia lipolytica AC A YC 5033 68,1 g/L κιτρικού οξέος, κατά την καλλιέργεια τους σε βιοαντιδραστήρες. Τέλος, όπως και ό,τι αναφέρθηκε στο προηγούμενο εδάφιο, καλλιέργεια αμφοτέρων των μικροοργανισμών σε εμπλουτισμένα με γλυκόζη ΥΑΔΠΕΕ τα οποία είχαν προηγουμένως παστεριωθεί και όχι αποστειρωθεί, είχε ως απόρροια σχεδόν ταυτόσημα κινητικά αποτελέσματα σε τις αντίστοιχες καλλιέργειες οι οποίες πραγματοποιήθηκαν υπό ασηπτικές συνθήκες, γεγονός το οποίο καθιστά τις προτεινόμενες βιοδιεργασίες (παραγωγή κιτρικού οξέος και/ή ΜΑ από υποστρώματα με βάση τα ΥΑΔΠΕΕ) βιομηχανικώς και τεχνολογικώς ενδιαφέρουσες. Στο τρίτο κεφάλαιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε η παραγωγή μεταβολικών προϊόντων κατά την αύξηση στελεχών των ειδών Rhodosporidium toruloides, Cryptococcus curvatus, Yarrowia lipolytica και Lipomyces starkeyi σε υποστρώματα με βάση τη βιομηχανική γλυκερόλη (χο κύριο υποπροϊόν της διεργασίας παραγωγής βιοντήζελ) και σε συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο, εις τρόπον ώστε να κατευθυνθεί ο κυτταρικός μεταβολισμός προς τη σύνθεση λιπιδίων (ή και κιτρικού οξέος και άλλων χαμηλού MB εξωκυτταρικών προϊόντων). Ο μικροοργανισμός Yarrowia lipolytica ACA YC 5033, όπως και στην περίπτωση της αύξησης του στη γλυκόζη παρήγαγε σε μη-αμελητέες ποσότητες κιτρικό οξύ, ενώ ο μικροοργανισμός Yarrowia lipolytica ACA YC 5029 παρήγαγε σε περίπου ισοβαρικές ποσότητες κιτρικό οξύ και μαννιτόλη (περί τα 7,0 g/L έκαστον των μεταβολιτών). Οι μικροοργανισμοί Cryptococcus curvatus NRRL Υ-1511, Rhodosporidium toruloides DSM 4444, Lipomyces starkeyi DSM 70296 και Rhodosporidium toruloides NRRL Y-27012 παρουσίασαν ικανοποιητική παραγωγή ξηράς κυτταρικής μάζας και λιπιδίων, σε ό,τι αφορά όμως στην παραγωγή λιπιδίων τα καλύτερα αποτελέσματα εδείχθησαν από τους μικροοργανισμούς Lipomyces starkeyi DSM 70296 και Rhodosporidium toruloides NRRL Y-27012. Οι ζύμες αυτές καλλιεργήθηκαν σε αυξανόμενες αρχικές συγκεντρώσεις γλυκερόλης με σταθερή αρχική συγκέντρωση αζώτου, και παρά το γεγονός ότι σε ορισμένες από τις περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκε πραγματικά πολύ υψηλή αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης (180 g/L), η παραγωγή ΜΑ και κυτταρικής μάζας από τους ανωτέρω μικροοργανισμούς ήταν πολύ ικανοποιητική. Ειδικότερα ο μικροοργανισμός Rhodosporidium toruloides NRRL Y-27012 παρήγαγε 30,1 g/L βιομάζας που περιείχαν λιπίδια σε ποσοστό 40,0% κ.β. ενώ ο μικροοργανισμός Lipomyces starkeyi DSM 70296 34,4 g/L βιομάζας που περιείχαν λιπίδια σε ποσοστό 35,9% κ.β.. Περαιτέρω, μελετήθηκε και η παραγωγή ενδοπολυσακχαριδίων από αμφότερους τους μικροοργανισμούς, με διαφορετικά κινητικά αποτελέσματα. Ο μικροοργανισμός Rhodosporidium toruloides NRRL Υ-27012 και παρά την αρχική παρουσία αζώτου στο περιβάλλον, εμφάνισε κατά τα πρώτα στάδια της αύξησης του υψηλά ποσοστά ενδοπολυσακχαριδίων επί ξηράς κυτταρικής μάζας, τα οποία μειώνονταν όσο η ζύμωση χωρούσε με ταυτόχρονη αύξηση της ποσότητας των ΜΑ, ενώ ο μικροοργανισμός Lipomyces starkeyi DSM 70296 εμφάνιζε από την αρχή μέχρι το τέλος της ζύμωσης σταθερά ποσοστά ενδοπολυσακχαριδίων επί ξηράς κυτταρικής μάζας και αυξανόμενα ποσοστά λιπιδίων. Η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη στη διεθνή βιβλιογραφία στην οποία εμφανίζεται παραγωγή ΜΑ από το μικροοργανισμό Lipomyces starkeyi κατά την αύξηση του στη γλυκερόλη, ενώ είναι η τρίτη για το μικροοργανισμό Rhodosporidium toruloides. Επίσης, η παρούσα εργασία είναι εκ των πρώτων στη διεθνή βιβλιογραφία στην οποία εμφανίζεται παραγωγή ενδοπολυσακχαριδίων από υποστρώματα με βάση την ακάθαρτη γλυκερόλη. Στο τελευταίο κεφάλαιο μελετήθηκε η παραγωγή μεταβολικών προϊόντων όταν χρησιμοποιήθηκαν ως υλικά εκκίνησης της ζύμωσης η λακτόζη και η σακχαρόζη. Ο σκοπός χρήσης των ανωτέρω υποστρωμάτων είναι αφ ενός να αξιολογηθεί η δυνατότητα παραγωγής μεταβολικών προϊόντων από τα σάκχαρα αυτά και αφ ετέρου σε επόμενο στάδιο να χρησιμοποιηθούν γεωργο- βιομηχανικά (υπο)-προϊόντα που περιέχουν τα ανωτέρω σάκχαρα ως υπόστρωμα (π.χ. τυρόγαλα, μελάσσες, κλπ). Από όσους μικροοργανισμούς χρησιμοποιήθηκαν στα προηγούμενα εδάφια, μόνο ο μικροοργανισμός Cryptococcus curuatus NRRL Υ-1511 μπορεί να αναλώσει τα ανωτέρω σάκχαρα, και ως εκ τούτου χρησιμοποιήθηκε σε αυτό το κεφάλαιο. Σε ένα πρώτο επίπεδο αξιολογήθηκε η αύξηση του μικροοργανισμού σε υποστρώματα αυξανόμενης συγκέντρωσης λακτόζης και υπό συνθήκες περιοριστικές σε άζωτο (δυνάμενες να επάγουν τη σύνθεση ΜΑ εντός των κυτταρικών δομών της ζύμης), και δείχτηκε ότι η συσσώρευση λιπιδίων (σε % κ.β. επί ξηράς μάζας) αυξήθηκε με την αύξηση της λακτόζης (μέγιστο ποσοστό λίπους 29,7% κ.β. στο πείραμα με αρχική συγκέντρωση λακτόζης 80 g/L). Περαιτέρω, ποσοτικοποιήθηκαν και τα ενδοκυτταρικά πολυσακχαρίδια του μικροοργανισμού σε συνάρτηση με το χρόνο, και το μέγιστο ποσοστό συνολικών ενδοκυτταρικών πολυσακχαριδίων επίσης αυξήθηκε (από 50 σε 65% κ.β. επί ξηράς μάζας) με την αύξηση της συγκέντρωσης λακτόζης, όμως η τάση ήταν να παρατηρείται μείωση του % κ.β. των συνολικών ενδοκυτταρικών πολυσακχαριδίων με την πάροδο της ζύμωσης (ενώ αντιθέτως παρατηρείτο αύξηση του % κ.β. των συνολικών λιπιδίων). Η κύρια δομική μονάδα των ενδοκυτταρικών πολυσακχαριδίων ήταν η γλυκόζη. Σε επόμενο στάδιο αξιολογήθηκε η παραγωγή κυτταρικής μάζας και λιπιδίων κατά την αύξηση του μικροοργανισμού σε υποστρώματα αυξανόμενης αρχικής συγκέντρωσης λακτόζης και υπό συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα, και η ταχύτητα κατανάλωσης λακτόζης αυξήθηκε πολύ σε σχέση με τα αντίστοιχα πειράματα που ήταν περιοριστικά σε άζωτο. Παρατηρήθηκε σε σχέση με τα περιοριστικά σε άζωτο πειράματα μείωση του ποσοστού των κυτταρικών λιπιδίων (σε % κ.β. επί ξηράς μάζας), ενώ, παρά το γεγονός ότι οι καλλιέργειες δεν ήταν περιοριστικές σε άζωτο, συστηματικά υψηλές συγκεντρώσεις ενδοκυτταρικών πολυσακχαριδίων παρατηρήθηκαν (30-45% κ.β. επί ξηράς μάζας), με το ποσοστό να διατηρείται σταθερό καθ' όλη τη διάρκεια της αύξησης. Όπως και στα προηγούμενα, η κύρια δομική μονάδα των πολυσακχαριδίων ήταν η γλυκόζη. Επίσης, πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της β-γαλακτοσιδάσης σε όλες τις πραγματοποιηθείσες καλλιέργειες, και δεν ανιχνεύτηκε ενζυμική ενεργότητα στο ελεύθερο κυττάρων θρεπτικό μέσο. Επίσης πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες με την εμπορική σακχαρόζη ως υλικό εκκίνησης, σε περιοριστικές τόσο σε άζωτο όσο και σε άνθρακα συνθήκες, και το κινητικό προφίλ ήταν αντίστοιχο όπως και της λακτόζης. Για τις περιοριστικές σε άζωτο συνθήκες, η τάση ήταν να παρατηρείται αρχικά υψηλή ενδοκυτταρική συγκέντρωση πολυσακχαριδίων με μείωση του % κ.β. των συνολικών ενδοκυτταρικών πολυσακχαριδίων με την πάροδο της ζύμωσης, ενώ αντιθέτως παρατηρείτο αύξηση του % κ.β. των συνολικών λιπιδίων. Για τις καλλιέργειες σε συνθήκες περιοριστικές σε άνθρακα, ο μικροοργανισμός συστηματικά παρουσίαζε υψηλές συγκεντρώσεις ενδοκυτταρικών πολυσακχαριδίων και χαμηλές συγκεντρώσεις λιπιδίων. Σε αντιδιαστολή με την μη-παραγωγή β-γαλακτοσιδάσης, η αύξηση στη σακχαρόζη συνοδεύτηκε από υψηλή παραγωγή ιμβερτάσης, από τις υψηλότερες της διεθνούς βιβλιογραφίας για άγρια στελέχη. Τέλος, μεγάλη παραγωγή βιομάζας και πολυσακχαριδίων παρατηρήθηκε και κατά την αύξηση του μικροοργανισμού σε περιοριστικά σε άνθρακα υποστρώματα με βάση τις μελάσες και το τυρόγαλα, ενώ για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία αναφέρεται η αλληλοδιαδοχή της παραγωγής πολυσακχαριδίων και λιπιδίων για ελαιογόνους μικροοργανισμούς. Η ανάλυση σε λιπαρά οξέα των συνολικών λιπιδίων για όλους τους μικροοργανισμούς έδειξε διαφοροποιήσεις σε σχέση με το χρόνο ζύμωσης και την αρχική συγκέντρωση υποστρώματος (σακχάρου ή γλυκερόλης), με κυρίαρχο λιπαρό οξύ να είναι το ελαϊκό. Στη δεύτερη θέση ευρίσκετο το λιπαρό οξύ παλμιτικό. Σε κάθε περίπτωση, το λίπος που παράγεται από όλους τους μελετηθέντες μικροοργανισμούς μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προάγγελος για τη σύνθεση βιολογικού πετρελαίου (βιοντήζελ).