Μελέτη των παραγόντων ριζοβολίας σε φυλλοφόρα μοσχεύματα ελιάς με έμφαση στην ποικιλία Καλαμών

Abstract

Τα φυλλοφόρα μοσχεύματα είναι σήμερα ο επικρατέστερος τρόπος αγενούς πολλαπλασιασμού της ελιάς σε παγκόσμιο επίπεδο. Όμως, η ικανότητα ριζοβολίας των μοσχευμάτων διαφέρει σημαντικά μεταξύ των ποικιλιών. Η ‘Καλαμών’ μία από τις καλύτερες επιτραπέζιες ποικιλίες στον κόσμο παρουσιάζει μικρά έως μηδενικά ποσοστά ριζοβολίας. Αντικείμενο της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η μελέτη των φυσιολογικών, βιοχημικών, γενετικών και ανατομικών παραγόντων που επηρεάζουν την ικανότητα ριζοβολίας των μοσχευμάτων της ποικιλίας αυτής σε σύγκριση με την ποικιλία ‘Arbequina’, η οποία συγκαταλέγεται στις εύκολα ριζοβολούντες ποικιλίες. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν στη μονάδα υδρονέφωσης των φυτωρίων Κωστελένου στον Πόρο Τροιζηνίας, ενώ οι σχετικές αναλύσεις έγιναν στα Εργαστήρια Δενδροκομίας, Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας και Βελτίωσης Φυτών και Γεωργικού Πειραματισμού του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών. Στο πρώτο μέρος της διατριβής, μελετήθηκε η επίδραση του υποστρώματος, των αυξινών και της εποχής, στη ριζοβολία των φυλλοφόρων μοσχευμάτων τριών ποικιλιών ελιάς (‘Καλαμών’, ‘Μαστοειδής’ και ‘Arbequina’). Τα πειράματα διεξήχθησαν το καλοκαίρι και το φθινόπωρο του 2008 και χρησιμοποιήθηκαν δύο αυξίνες, το ινδολοβουτυρικό οξύ (ΙΒΑ) και το α-ναφθαλινοξικό οξύ (α-ΝΑΑ) σε διάφορες συγκεντρώσεις καθώς και συνδυασμοί αυτών, σε δύο υποστρώματα ριζοβολίας (οργανικό και τύρφη-περλίτη). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το οργανικό υπόστρωμα έδωσε το υψηλότερο ποσοστό ριζοβολίας και αριθμό ριζών σε σύγκριση με την τύρφη-περλίτη για όλες τις ποικιλίες. Η ‘Arbequina’ έδωσε τα υψηλότερα ποσοστά ριζοβολίας (μέχρι 96%), ακολούθησε η ‘Μαστοειδής’ με 60% και η ‘Καλαμών’ με 2-3%. Οι ποικιλίες ‘Arbequina’ και ‘Μαστοειδής’ ριζοβόλησαν σε υψηλότερο ποσοστό το φθινόπωρο. Το ΙΒΑ 2000 mg L-1 προώθησε καλύτερα τη ριζοβολία στις ποικιλίες ‘Arbequina’ και ‘Καλαμών’, ενώ στη ‘Μαστοειδής’ το ΝΑΑ σε συγκέντρωση 1000 mg L-1. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, μελετήθηκε η επίδραση του ΙΒΑ, της ποικιλίας και της συγκέντρωσης των ενδογενών υδατανθράκων, πολυαμινών και φαινολικών ενώσεων, καθώς και η ενεργότητα των ενζύμων στη ριζοβολία των φυλλοφόρων μοσχευμάτων ελιάς σε τρεις περιόδους (καλοκαίρι, φθινόπωρο και άνοιξη, 2009-2010). Χρησιμοποιήθηκαν μοσχεύματα των ποικιλιών ‘Arbequina’ και ‘Καλαμών’ με μήκος περίπου 7 cm, διάμετρο 5 mm και 4 φύλλα. Στη βάση τους εφαρμόστηκε IBA 2000 mg L-1. Στο τέλος της περιόδου ριζοβολίας μετρήθηκε το ποσοστό των μοσχευμάτων που ριζοβόλησαν ή σάπισαν ή σχημάτισαν κάλλο. Για τη μέτρηση των διαφόρων βιοχημικών παραγόντων έγινε δειγματοληψία της βάσης των μοσχευμάτων στην αρχή και στην περίοδο των πρώτων δεκαπέντε ημερών της ριζοβολίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η εξωγενής εφαρμογή ΙΒΑ προώθησε τη ριζοβολία στα μοσχεύματα της ποικιλίας ‘Arbequina’ αλλά όχι στην ‘Καλαμών’ (ποσοστό ριζοβολίας 1-3%). Το υψηλότερο ποσοστό ριζοβολίας της ‘Arbequina’ (76%) επιτεύχθηκε το καλοκαίρι. Τα μοσχεύματα της ‘Arbequina’ παρουσίασαν στατιστικά σημαντικά υψηλότερες αρχικές, αλλά και στην πορεία της ριζοβολίας συγκεντρώσεις σταχυόζης, ραφινόζης, σακχαρόζης, γλυκόζης, μαννιτόλης, ολικών σακχάρων, ελεύθερων και ολικών πολυαμινών από αυτά της ‘Καλαμών’ καθώς και χλωρογενικού οξέος και άλλων φαινολικών ουσιών. Αντίθετα, τα μοσχεύματα της ‘Καλαμών’ είχαν στατιστικά σημαντικά υψηλότερη συγκέντρωση φρουκτόζης, αμύλου, βερμπασκοζίτη, ελευρωπαΐνης και υψηλότερη ενεργότητα υπεροξειδάσης (POD), πολυφαινολοξυδάσης (PPO) και οξειδάσης του ινδολοξικού (IAA oxidase), σε σχέση με την ‘Arbequina’. Στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ της ριζοβολίας της ‘Arbequina’ και των αρχικών συγκεντρώσεων της γλυκόζης, της φρουκτόζης, των ολικών σακχάρων, της υδροξυτυροσόλης, της τυροσόλης, του 7-γλυκοζίτη της λουτεολίνης και της λουτεολίνης. Αντίθετα, βρέθηκε στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ της ριζοβολίας της ‘Arbequina’ και της αρχικής συγκέντρωσης της ραφινόζης, της σακχαρόζης, του αμύλου και των ολικών φαινολικών ενώσεων. Στην ‘Καλαμών’ παρατηρήθηκε η ύπαρξη θετικής συσχέτισης μεταξύ της ριζοβολίας και της αρχικής συγκέντρωσης των ολικών ο-διφαινολών, του βερμπασκοζίτη και της ελευρωπαΐνης, ενώ αρνητική ήταν με την αρχική συγκέντρωση της ραφινόζης, της φρουκτόζης και των ολικών φλαβονοειδών. Συμπεραίνεται ότι η εποχική διακύμανση της ριζοβολίας της ‘Arbequina’ πιθανόν σχετίζεται με τις ταυτόχρονες αλλαγές στις συγκεντρώσεις των υδατανθράκων στα μοσχεύματα αυτής. Οι πολυαμίνες και ιδίως στην ελεύθερή τους μορφή εμπλέκονται στη ριζογένεση στα μοσχεύματα της ελιάς. Επιπλέον, οι φαινολικές ουσίες φαίνεται να δρουν ως πιθανοί συνεργιστές της ριζοβολίας. Η υψηλότερη ενεργότητα όλων των ενζύμων στην ποικιλία ‘Καλαμών’ πιθανόν να παίζει σημαντικό ρόλο στην παρεμπόδιση της ριζοβολίας της. Με βάση τα πιο πάνω αποτελέσματα, στο τρίτο μέρος της διατριβής μελετήθηκε η επίδραση του εξωγενούς χλωρογενικού οξέος (CGA) και άλλων ουσιών στη ριζοβολία των μοσχευμάτων της ‘Καλαμών’. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν τρία πειράματα ριζοβολίας (2010-2012). Στο πρώτο πείραμα χρησιμοποιήθηκαν μοσχεύματα των ποικιλιών ‘Arbequina’ και ‘Καλαμών’, ενώ στα άλλα δύο μόνο της ‘Καλαμών’. Στο τρίτο πείραμα εκτός από τα ποσοστά ριζοβολίας, μετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις των διαλυτών σακχάρων, των φαινολικών ενώσεων, των πολυαμινών και η ενεργότητα ορισμένων ενζύμων στη βάση των μοσχευμάτων. Τα αποτελέσματα του πρώτου πειράματος έδειξαν ότι η καλύτερη περίοδος για ριζοβολία της ποικιλίας ‘Καλαμών’ ήταν το φθινόπωρο, ενώ τα μοσχεύματα της ποικιλίας ‘Arbequina’ ριζοβόλησαν σε υψηλά ποσοστά και τις δύο εποχές (καλοκαίρι και φθινόπωρο). Η εφαρμογή 10 mM πουτρεσκίνης ή 10 mM CGA ή ρουτίνης στο υπόστρωμα έδωσαν τα καλύτερα αποτελέσματα ριζοβολίας στην ‘Arbequina’ (μέχρι 100%). Στην ποικιλία ‘Καλαμών’ παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της ριζοβολίας σε ποσοστό 25% (δηλαδή 400% αύξηση σε σχέση με το ΙΒΑ 2000 mg L-1) κατόπιν εφαρμογής 0,1 mM CGA για 30 min. Στο δεύτερο πείραμα η ‘Καλαμών’ έδωσε πάλι το υψηλότερο ποσοστό ριζοβολίας το φθινόπωρο. Η εφαρμογή CGA για 30 min ανεξαρτήτου συγκέντρωσης αύξησε σημαντικά τη ριζοβολία, με τη συγκέντρωση των 0,1 mM να εμφανίζει το υψηλότερο ποσοστό (25%). Τα αποτελέσματα του τρίτου πειράματος έδειξαν ότι τα μοσχεύματα που μεταχειρίστηκαν με 0,1 mM CGA είχαν στατιστικά σημαντικά υψηλότερη συγκέντρωση μεμονωμένων σακχάρων και αμύλου σε σχέση με αυτά του μάρτυρα. Το CGA αύξησε επίσης τη συγκέντρωση των ολικών φαινολικών ενώσεων, ολικών ο-διφαινολών, ολικών φλαβονοειδών, ολικών φλαβανολών, ολικής πουτρεσκίνης, ολικής σπερμιδίνης καθώς και την ολική συγκέντρωση των πολυαμινών σε σχέση με το μάρτυρα. Αντίθετα, τα ίδια μοσχεύματα είχαν μειωμένη ενεργότητα των ενζύμων PPO, POD και IAA oxidase. Συμπεραίνεται, ότι η εφαρμογή εξωγενώς του CGA μπορεί να προωθήσει τη ριζοβολία στα μοσχεύματα της ‘Καλαμών’. Η δράση του μάλιστα σχετίζεται εκτός των άλλων και με την επίδρασή του στα ενδογενή επίπεδα των διαλυτών σακχάρων, των φαινολικών ενώσεων, των πολυαμινών και την ενεργότητα των ενζύμων. Στο τέταρτο μέρος της εργασίας, μελετήθηκαν οι ανατομικές διαφορές μεταξύ των δύο ποικιλιών ελιάς και προσδιορίστηκαν τα σημεία έναρξης της ριζοβολίας με τη χρήση του οπτικού μικροσκοπίου. Οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι μεταξύ των δύο ποικιλιών υπήρχαν ανατομικές διαφορές. Στα μοσχεύματα της ποικιλίας ‘Arbequina’ ο σκληρεγχυματικός δακτύλιος εμφανίζει σε αρκετά σημεία κενά όπως και το φλοιώδες παρέγχυμα, σε αντίθεση με την ποικιλία ‘Καλαμών’ όπου ο σκληρεγχυματικός δακτύλιος ήταν συνεχής και το φλοιώδες παρέγχυμα συμπαγές. Επίσης, βρέθηκε ότι και στις δύο ποικιλίες η θέση έναρξης σχηματισμού του ριζικού αρχεγόνου ήταν από κύτταρα του καμβίου. Συμπεραίνεται ότι η ριζογένεση στην ποικιλία ‘Καλαμών’ καθορίζεται γενετικά και εξαρτάται κυρίως από φυσιολογικούς και βιοχημικούς παράγοντες. Πρόσθετα όμως, η ανατομία των βλαστών της μπορεί να επηρεάζει αρνητικά τη ριζοβολία της. Ειδικότερα, η ύπαρξη συνεχούς σκληρεγχυματικού δακτύλιου και το συμπαγές φλοιώδες παρέγχυμα μπορεί να δυσχεραίνουν την απορρόφηση της αυξίνης και επομένως τη δράση της στο σχηματισμό των ριζικών καταβολών. Τέλος, μελετήθηκε σε μοριακό επίπεδο η ριζοβολία των μοσχευμάτων ελιάς μέσω της απομόνωσης και της ανάλυσης γονιδίων διαφορικά εκφραζόμενων σε μοσχεύματα που ριζοβολούν εύκολα και σε μοσχεύματα που ριζοβολούν δύσκολα, με την τεχνική του Κατασταλτικού Αφαιρετικού Υβριδισμού. Πραγματοποιήθηκαν δύο μοριακές αφαιρέσεις (‘Arbequina’-‘Καλαμών’ και ‘Καλαμών’-‘Arbequina’) και κατασκευάστηκαν δύο αφαιρετικές cDNA βιβλιοθήκες, όπου η μία περιλαμβάνει τα γονίδια που εκφράζονται στην ‘Arbequina’ και δεν εκφράζονται στην ‘Καλαμών’ και η άλλη περιλαμβάνει τα γονίδια που εκφράζονται στην ‘Καλαμών’ και δεν εκφράζονται στην ‘Arbequina’. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα απομονωθέντα τμήματα cDNA διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων είναι ομόλογα με γονίδια που κωδικεύουν πρωτεΐνες και ένζυμα τα οποία εμπλέκονται στους μηχανισμούς άμυνας των φυτών, στο μεταβολισμό των υδατανθράκων και των λιπαρών οξέων, στη βιοσύνθεση των φαινυλοπροπανοειδών, στην οργανογένεση, στην κυτταροδιαίρεση, στη διαφοροποίηση των κυττάρων, στη βιοσύνθεση και τον καταβολισμό του ινδολοξικού οξέως (ΙΑΑ) κ.ά. Τα γονίδια αυτά που εντοπίστηκαν, είτε όταν εκφράζονται είτε όταν καταστέλλεται η έκφρασή τους, ενδεχομένως να σχετίζονται με ορισμένες από τις φυσιολογικές και βιοχημικές διεργασίες της ριζοβολίας των μοσχευμάτων ελιάς.

Vegetative propagation of olive (Olea europaea L.) is performed by rooting leafy cuttings. However, there are great differences in the rooting potential among olive cultivars (cvs). The cv ‘Kalamata’, one of the world’s best table olive variety, has low to almost zero rooting percentages. The objectives of this study were to examine the effect of physiological, biochemical, anatomical and molecular factors in the rooting potential of ‘Kalamata’ cuttings in relation to the easy-to- root cv ‘Arbequina’. The rooting experiments were conducted in a mist propagation unit at Kostelenos nurseries, located in Troizinia area (Poros), Greece, while the analysis of samples was carried out in the laboratories of Pomology, Electron Microscopy and Plant Breeding and Biometry of the Agricultural University of Athens, Greece. In the first part of the thesis, the effect of rooting substrate, auxin and the season on rooting ability of olive cuttings of three cvs (‘Arbequina’, ‘Kalamata’ and ‘Mastoidis’) was studied. The rooting experiments were conducted in the summer and autumn (2008) with two auxins, namely indole-butyric acid (IBA) and α-naphthaleneacetic acid (α-NAA), at different concentrations and combinations in two rooting substrates. The results showed that the cuttings of all cvs rooted better in the organic substrate, with a higher number of roots compared to peat-perlite substrate. The cv ‘Arbequina’ gave the highest rooting (up to 96%), followed by cv ‘Mastoidis’ with 60% and ‘Kalamata’ with 2.3%. ‘Arbequina’ and ‘Mastoidis’ rooted at a higher percentage in the fall. Exogenous application of IBA at 2000 mg L-1 significantly increased the % rooting of cuttings in ‘Arbequina’ and ‘Kalamata’, while in ‘Mastoideis’, NAA at 1000 mg L-1 gave better results. In the second section of this study, the objectives were to examine the effect of cultivar, IBA, endogenous carbohydrates, polyamines and phenolic compounds, as well as the activity of enzymes on the rooting ability of olive cuttings in three seasons (summer, autumn and spring, 2010-2011). The selected cvs were ‘Arbequina’ and ‘Kalamata’. Sub-apical leaf bearing cuttings 7-10 cm long and about 5 mm in diameter were cut having four leaves. The base of each cutting was treated for 5 sec with 2000 mg L-1 IBA. At the end of the rooting period (3 months after planting), the percentage of rooted cuttings, the number of cuttings with callus and the number of rotten cuttings were recorded. For the measurement of various biochemical factors, subsamples of the base of cuttings were taken just before planting (day 0) and in the course of 15 days of rooting (1, 3, 5, 7 and 15 days after planting). The results showed that the exogenous application of IBA at 2000 mg L-1 significantly increased the rooting percentage in the easy-to-root cv ‘Arbequina’. However, in the root recalcitrant cv ‘Kalamata’, IBA treatment was ineffective (1-3 % rooting). Rooting percentage of ‘Arbequina’ cuttings was highest in summer (76%). The concentrations of stachyose, sucrose, glucose, mannitol and total sugars, as well as free and conjugated polyamines, chlorogenic acid and other phenolic compounds, were significantly higher in ‘Arbequina’ as compared to ‘Kalamata’, both initially and during the 15 days of rooting. On the other hand, ‘Kalamata’ had significantly higher fructose, starch, verbascoside and oleuropein concentrations, as well as higher polyphenoloxidase (PPO), peroxidase (POD) and IAA oxidase activity. A positive correlation was found between rooting percentage and initial glucose, fructose, total concentrations of sugar, initial hydroxytyrosol, tyrosol, 7-luteolin glucoside and luteolin in cv ‘Arbequina’. On the other hand, a negative correlation was found between the initial concentrations of raffinose, sucrose, starch, total phenols and rooting percentage in ‘Arbequina’ cuttings. Furthermore, in ‘Kalamata’, a positive correlation was found between the initial concentrations of verbascoside, oleuropein, total o-diphenols and rooting percentage, while a negative correlation was found between the initial concentrations of raffinose, fructose or total flavonoids and rooting percentage. It is concluded that the seasonal variation in rooting of cv ‘Arbequina’ is possibly related to simultaneous changes in the carbohydrate concentrations. Furthermore, the results of the present study demonstrate the essential role of polyamines, especially in their free form, for root formation in olive cuttings, as well as the role of phenolic compounds as cofactors in the rooting process. Finally, the highest enzyme activity (PPO, POD and IAA oxidase) observed in cv ‘Kalamata’ is likely to inhibit root initiation and formation in these cuttings. Based on the results above, the third part of the thesis studied the effect of exogenously applied chlorogenic acid (CGA) and other substances on the rooting ability of ‘Kalamata’ cuttings. For this purpose, three rooting experiments were performed (2010-2012). In the first experiment, the selected cvs were ‘Arbequina’ and ‘Kalamata’, while in the second and third experiment the selected cuttings were only from cv ‘Kalamata’. Furthermore in the third experiment, apart from rooting percentages, the concentrations of soluble sugars, phenolic compounds, polyamines and the activity of certain enzymes in the base of the cuttings, were also studied. The results of the first experiment showed that the best period for rooting of both cvs is autumn. In ‘Arbequina’ cuttings, highest rooting percentage (100%) was observed for the exogenous application of 10 mM putrescine, of 10 mM CGA, and with the application of rutin in the rooting medium, while in ‘Kalamata’ the exogenous application of 0.1 mM CGA for 30 minutes significantly increased the rooting percentage up to 25%. In the second experiment, cv ‘Kalamata’ again rooted better in autumn. The exogenous application of CGA for 30 minutes, regardless of concentration, significantly increased the rooting, with 0.1 mM being the best concentration for rooting (25%). Finally, the results of the third experiment showed that treatment with 0.1 mM CGA led to significantly higher concentrations of total sugars and starch compared to the control cuttings. Similarly, CGA application significantly increased the concentrations of total phenols, total o-diphenols, total flavonoids, total flavanols, total putrescine and total spermidine, as well as the concentration of total polyamines compared to control. However, the activity of PPO, POD and IAA oxidase decreased in these cuttings. Therefore, it could be concluded that the exogenous application of 0.1 mM CGA appears to promote the rooting of ‘Kalamata’ cuttings (up to 400% compared to IBA 2000 mg L-1 alone) and its action is related, among others, with its effect on the endogenous levels of soluble sugars, phenolic compounds, polyamines and with the activity of the above mentioned enzymes. The objectives of the fourth part of this study were to examine the anatomical differences between the cvs ‘Kalamata’ and ‘Arbequina’ and to identify the sites of initiation of root primordia with the use of light microscopy. The histological sections of basal stem segments showed that there are differences in the anatomy between the two cvs. ‘Kalamata’ cuttings had a continuous sclerenchyma ring and denser cortex, while ‘Arbequina’ cuttings are characterized by discontinuity of the sclerenchyma ring and intercellular spaces in the cortex. Furthermore, the anatomical observations showed that the sites of root initiation in both cvs originate from cells in the cambium region. It is concluded that the rooting process in ‘Kalamata’ is genetically determined and depends mainly on physiological and biochemical factors. Additionally, the shoot anatomy may adversely affect the rooting of ‘Kalamata’ cuttings. In particular, the continuous sclerenchyma ring as well as the denser cortex may hinder the absorption of auxin and thus its effect on the formation of root initials. The rooting of olive cuttings was studied at the molecular level via the isolation and identification of differentially expressed genes in an easy-to-root and a root recalcitrant olive cv by the technique of suppression subtractive hydridization (SSH). Two cDNA libraries were constructed (‘Arbequina’-‘Kalamata’ and ‘Kalamata’-‘Arbequina’). The first library containing the clones of genes expressed in ‘Arbequina’ but not in ‘Kalamata’ whereas the second the clones of genes expressed in ‘Kalamata’, but not in ‘Arbequina’. The results obtained indicate genes that encode proteins and enzymes which are involved in plant defence mechanisms, carbohydrate and fatty acid metabolism, phenylpropanoid biosynthesis, organogenesis, cell division and differentiation, biosynthesis and catabolism of indoleacetic acid etc. The expression or gene expression suppression of identified genes possibly could be associated with some physiological processes involved in the rhizogenesis of olive leafy cuttings.