Διερεύνηση και ανάπτυξη μηχανισμών γενετικής και μεμβρανικής τροποποίησης κυττάρων για χρήση σε βιοαισθητήρες

Abstract

Η σύγχρονη βιομηχανία φυτοπροστατευτικών προϊόντων για να καταπολεμήσει τα προβλήματα που έχουν δημιουργηθεί από την αύξηση της ανθεκτικότητας των εντόμων στα φυτοπροστατευτικά προϊόντα καταβάλλει τεράστιες προσπάθειες για την έρευνα νέων εντομοκτόνων που στοχεύουν σε διαφορετικά βιοχημικά και φυσιολογικά ενεργά κέντρα. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν 2 σχετικά νέες κατηγορίες εντομοκτόνων, τα νεονικοτινοειδή και τα αμίδια του τετρονικού οξέος με απώτερο σκοπό την ανάπτυξη κυτταρικού βιο-αισθητήρα που θα ανιχνεύει την ύπαρξη υπολειμμάτων τους σε λαχανικά. Η παρούσα μελέτη απαρτίζεται από 3 μέρη. Στο 1ο μέρος της μελετώνται οι τοξικολογικές επιδράσεις 8 εντομοκτόνων με διαφορετικές χημικές δομές, 3 αμιδίων του τετρονικού οξέος (spiromesifen, spirodiclofen, spirotetramat) και 5 νεονικοτινοειδών (imidacloprid, clothianidin, thiacloprid, acetamiprid, thiamethoxam) σε διαφοροποιημένα και σε μη διαφοροποιημένα κύτταρα νευροβλαστώματος (N2a) που θα αποτελέσουν στη συνέχεια το βιολογικό κομμάτι του κυτταρικού βιο-αισθητήρα. Τα κύτταρα κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας εκτέθηκαν σε τέσσερεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του κάθε εντομοκτόνου (3, 10, 30 και 100μΜ) για 24 και 48 ώρες σε συνθήκες που ευνοούσαν και που δεν ευνοούσαν τη διαφοροποίηση τους. Κατόπιν, για την εκτίμηση της κυτταροτοξικότητας/βιωσιμότητας των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν οι βιοχημικές δοκιμές πρόσληψης των χρωστικών ΜΤΤ, ουδέτερου ερυθρού (NR) και ιωδιούχου προπιδίου (PI) όπου τα αμίδια του τετρονικού οξέος προκάλεσαν αυξημένη μείωση της βιωσιμότητας στις συγκεντρώσεις 30 και 100 μΜ. Παράλληλα μελετήθηκε μικροσκοπικά η παρεμπόδιση της προέκτασης των νευρικών αξόνων με χρώση των κυττάρων με Coomassie Brilliant Blue. Ο προσδιορισμός του μεμβρανικού δυναμικού και της συγκέντρωσης του ενδοκυτταρικού ασβεστίου ([Ca2+]) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των χρώσεων DiSC3(5) και Fluo-3 αντίστοιχα σε φωτόμετρο φθορισμού. Τα εντομοκτόνα προκάλεσαν αποπόλωση της κυτταρικής μεμβράνης καθώς και αύξηση της πρόσληψης του ενδοκυτταρικού [Ca2+] κυρίως στις συγκεντρώσεις 30 και 100 μΜ και στις δυο κατηγορίες κυττάρων. Επιπλέον πραγματοποιήθηκαν βιοχημικές μελέτες για την επίδραση των εντομοκτόνων στους ενζυμικούς και βιολογικούς αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς των κυττάρων. Συγκεκριμένα μετρήθηκαν η δραστικότητα των ενζύμων S-τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST), δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) με τη μέθοδο του νιτρο-μπλε τετραζολίου (ΝΒΤ), η υπεροξέιδωση των λιπιδίων με τη μέθοδο του θειοβαρβιτουρικού οξέος (ΤΒΑ) καθώς και η μεταβολή της συγκέντρωσης της ανηγμένης και της οξειδωμένης γλουταθειόνης με τη μέθοδο Ellman. Παρατηρήθηκε ότι τα εντομοκτόνα αύξησαν την ενεργότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων και της MDA μειώνοντας ταυτόχρονα τα επίπεδα της γλουταθειόνης, κυρίως στις υψηλές συγκεντρώσεις. Με την ίδια μέθοδο πραγματοποιήθηκε και προσδιορισμός της δραστικότητας του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση (AChE) η οποία φάνηκε να αυξάνεται τόσο από την επίδραση των νεονικοτινοειδών όσο και από την επίδραση των αμιδίων του τετρονικού οξέος. Για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης των ολικών πρωτεϊνών των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Bradford. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μεμβρανική τροποποίηση κυττάρων Vero με το ένζυμο AChE για μελλοντική χρήση τους ως βιολογικό κομμάτι του κυτταρικού βιο-αισθητήρα, μέσω των μεθόδων της ηλεκτροπόρωσης και της οσμωτικής ένθεσης και εκτιμήθηκε κατόπιν η βιωσιμότητα των κυττάρων καθώς και η ενεργότητα του ενζύμου στα κύτταρα. Παρατηρήθηκε ότι κύτταρα που τροποποιήθηκαν με τη μέθοδο της οσμωτικής ένθεσης παρουσίασαν αυξημένη βιωσιμότητα ενώ αυξήθηκε και η δραστικότητα του ενζύμου AChE. Στο 2ο μέρος της διατριβής αναπτύχθηκε επίσης 1| μία μέθοδος ανίχνευσης υπολειμμάτων νεονικοτινοειδών και αμιδίων του τετρονικού οξέος σε υποστρώματα αγγουριού και τομάτας μετά από εξεργασία των δειγμάτων με τη μέθοδο QuEChERS. Τα αποτελέσματα της μεθόδου χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων του κυτταρικού βιοαισθητήρα που αναπτύχθηκε στη συνέχεια. Τέλος κατά το 3ο μέρος της διατριβής, αναπτύχθηκε μέθοδος προσδιορισμού των εντομοκτόνων σε ποτενσιοστάτη σε εκτυπωμένα ηλεκτρόδια άνθρακα με τη χρήση κυττάρων N2a (κυτταρικός βιοαισθητήρας) και χωρίς τη χρήση κυττάρων N2a με τη μέθοδο της διαφορικής παλμικής βολταμετρίας. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι τα διαφοροποιημένα κύτταρα αποτελούν ένα εξαιρετικό εργαλείο μελέτης της νευροβιολογίας και της νευροτοξικότητας αφού παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα ευαισθησίας τους σε φυτοπροστατευτικά προϊόντα και ξενοβιοτικά και μελλοντικά αναμένεται να έχουν βασικό ρόλο στην ανάπτυξη κυτταρικών βιοαισθητήρων πολύ υψηλής εκλεκτικότητας και ευαισθησίας.

Modern crop protection industry puts considerable efforts in the search for new pesticides (insecticides, acaricides) acting on novel biochemical and physiological targets, primarily due to the seriously increasing problem of pest resistance to pesticides. In this study we investigated 2 relatively new insecticide classes, neonicotinoids and tetronic acid amides in order to build a cellular biosensor for the detection of their residues in vegetables. The study consists of 3 parts. The first part is focused on investigating the toxicological effects of eight insecticides with different chemical structures, three tetronic acid amides (spiromesifen, spirodiclofen, spirotetramat) and five neonicotinoids (imidacloprid, clothianidin, thiacloprid, acetamiprid, thiamethoxam) on differentiating and non- differentiating mouse N2a neuroblastoma cells. The N2a cells will be used as the biosensor’s biological part. The cells were exposed to four different concentrations of each insecticide (3, 10, 30 and 100 μΜ) for 24 and 48 hours under differentiating and non-differentiating conditions. Cytotoxicity and cell viability were estimated by the MTT, neutral red uptake (NRU) assays, propidium iodide (PI) uptake assays. Tetronic acid amides caused an increased cytotoxicity at the two highest concentrations (30 and 100 μΜ). In addition, the axon outgrowth impairment was measured microscopically after a coomassie brilliant blue staining. Membrane potential and intracellular calcium concentration ([Ca2+]), were measured using the dye probes DiSC3(5) and Fluo-3, respectively with a fluorescence plate reader. Βοth pesticide classes increased cellular depolarization and [Ca2+] uptake in both cell types at the two highest concentrations. Furthermore, the effects of the insecticides on the enzymatic and biological antioxidative cell mechanisms were studied. More specifically, Glutathione S Transferase (GST) and Superoxide dismutase (SOD) activities were measured photometrically, lipid peroxidation was measured by the thiobarbituric acid assay (TBA) and the change at the levels of GSH and GSSG concentrations were measured by the Ellman method. The results showed an increase in the antioxidant enzymes specific activities as well as an increase at the malondialdehyde‘s (MDA) concentration. The insecticides also reduced GSH levels at the highest concentrations. The same assay was used for the determination of Acetylcholinesterase (AChE) activity. The total protein concentration was determined 3 | by the Bradford method. In addition, AChE was inserted to Vero cell membranes through electroinsertion and osmotic insertion. In the future, these cells will be used as the biosensor’s biological part. Afterwards, Vero cell viability and ΑChE have been assessed. Osmotic insertion of AChE to Vero cells induced AChE’s activity and had minimum effect on cell viability. In the framework of the current thesis, in the 2nd part, an analytical method was developed for the determination of neonicotinoids and tetronic acid amides in cucumber and tomato matrices after extraction by the QuEChERS method. The results were compared afterwards with the cellular biosensors’ results. Finally, in the 3rd part, a potentiometric method (differential pulse voltametry) employing carbon screen printed electrodes for the determination of the insecticides has been developed, with or without N2a- based cellular biorecognition elements. Our results suggest that differentiated N2a cells are more sensitive to pesticides than non-differentiated cells and represent a very important tool for neurobiology and neurotoxicity studies. In the near future they will play a key role in the field of cellular biosensors of high selectivity and specificity.