Στην παρούσα διδακτορική διατριβή έγινε η προσπάθεια να διασαφηνιστεί η δομή και ο ρόλος των ιδιοβλαστών που σχηματίζουν κυτταρικά έγκλειστα οξαλικού και ανθρακικού ασβεστίου στα φυτά Vitis vinifera (ευρωπαϊκή άμπελοςι), Amaranthus hybridus (βλήτο) και Parietaria judaica (περδικάκι) και η πιθανή συμβολή τους στη φωτοσύνθεση. Στη διεθνή βιβλιογραφία δεν υπάρχουν επαρκή πειραματικά δεδομένα σχετικά με το ρόλο των εγκλείστων αυτών. Η αποθήκευση και η ρύθμιση του Ca, η φυτοπροστασία και η αποτοξίνωση βαρέων μετάλλων είναι μερικοί από τους ρόλους που έχουν προταθεί. Ωστόσο, πειραματικά δεδομένα της ερευνητικής μας ομάδας έχουν δείξει ότι τα κυτταρικά έγκλειστα αποτελούν δυναμικές δομές και όχι τελικά προϊόντα του μεταβολισμού. Ως εκ τούτου διατυπώθηκε η υπόθεση εργασίας σύμφωνα με την οποία τα κυτταρικά έγκλειστα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διαχείριση του άνθρακα των φωτοσυνθετικών ιστών και στη απόδοση CO2 για την πραγματοποίηση της φωτοσύνθεσης σε συνθήκες πενίας άνθρακα («φωτοσύνθεση κινδύνου»). Επίσης διατυπώθηκε η υπόθεση ότι τα έγκλειστα σχηματίζονται κατά τα πρώτα στάδια ανάπτυξης των φύλλων, όταν τα στομάτια δεν είναι πλήρως λειτουργικά.
Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω πραγματοποιήθηκε πείραμα κατά το οποίο συλλέχθηκαν, και από τα τρία πειραματόφυτα, φύλλα διαφορετικής ηλικίας, εκφραζόμενης από την επιφάνειά τους, και στη συνέχεια μετρήθηκαν και συσχετίστηκαν οι παράμετροι: ρυθμός φωτοσύνθεσης, ρυθμός διαπνόης, υποστοματική συγκέντρωση CO2, στοματική αγωγιμότητα, πυκνότητα κυτταρικών εγκλείστων και συνολικός αριθμός κυτταρικών εγκλείστων ανά φύλλο. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως τα κυτταρικά έγκλειστα σχηματίζονται από τα πρώτα κιόλας στάδια έκτπυξης των φύλλων. Η πυκνότητά τους είναι αρχικά υψηλή και στη συνέχεια μειώνεται και σταθεροποιείται. Αντίθετη πορεία ακολουθεί ο συνολικός αριθμός τους ο οποίος αυξάνεται αλλά φτάνει σύντομα σε μέγιστη τιμή όπου και σταθεροποιείται. Παράλληλα, τα φύλλα φωτοσυνθέτουν σε μικρό βαθμό από τα πρώτα κιόλας στάδια της έκπτυξης τους χωρίς ωστόσο να έχουν τη δυνατότητα ανταλλαγής αερίων.
Σε επόμενο πείραμα ελέγχθηκε η μεταβολή του όγκου των κυτταρικών εγκλείστων στο βλήτο και το περδικάκι σε συνθήκες πενίας άνθρακα. Συνθήκες πενίας άνθρακα επικρατούν in planta όταν τα στομάτια κλείνουν είτε λόγω υδατικής καταπόνησης είτε λόγω επικράτησης δυσμενών καιρικών συνθηκών. Ένας αριθμός φύλλων κατηγοριοποιήθηκε σε δύο ομάδες χειρισμών: φύλλα control και φύλλα που αναπτύχθηκαν σε συνθήκες πενίας άνθρακα (υδατική καταπόνηση, εφαρμογή ΑΒΑ ή/και παραμονή στο σημείο αντιστάθμησης για το CO¬¬2). Μετά από παραμονή του κάθε χειρισμού κάτω από συνθήκες συνεχούς φωτισμού για 24 και 48 ώρες μετρήθηκε ο όγκος των κυτταρικών εγκλείστων. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως τα φύλλα στα οποία εφαρμόστηκε πενία άνθρακα εμφάνισαν σημαντικά μικρότερο όγκο κυτταρικών εγκλειστων (40-50 %) σε σχέση με τα φύλλα control. Στο περδικάκι, η προσθήκη ανθρακικών στο θρεπτικό διάλυμα των φύλλων της πενίας άνθρακα αντέστρεψε το φαινόμενο και οι κυστόλιθοι επανέκτησαν τις αρχικές τιμές του όγκου τους σε μικρό χρονικό διάστημα.
Το ανθρακικό ασβέστιο διαλύεται ελεύθερα στο υδατικό περιβάλλον, ενώ το οξαλικό οξύ εικάζεται πως οξειδώνεται ενζυμικά προς CO2 και Η2Ο2 με τη δράση του ενζύμου οξαλική οξειδάση. Για την επιβεβαίωση της λειτουργίας του μηχανισμού αυτού πραγματοποιήθηκε πείραμα ιστοχημικού εντοπισμού της οξαλικής οξειδάσης αλλά και της καταλάσης σε φύλλα control και φύλλα στα οποία εφαρμόστηκε πενία άνθρακα. Η οξαλική οξειδάση εντοπίστηκε στα κύτταρα του σπογγώδους παρεγχύματος των φύλλων και κυρίως στις κυτταρικές μεμβράνες ή τα κυτταρικά τοιχώματα. Μάλιστα σε κάθε χειρισμό δεν εμφανίστηκε χρώση στα κύτταρα του κολεού της δέσμης. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα σχετικά με την θέση της καταλάσης στους ιστούς των φύλλων. Ο βαθμός κατά τον οποίο αυξήθηκε η δραστικότητα της οξαλικής οξειδάσης ελέγθηκε με ενζυμική δοκιμή. Τα αποτελέσματα, αφενός επιβεβαίωσαν τον ιστοχημικό εντοπισμό αφού δραστικότητα εμφανίστηκε μόνο στο κλάσμα των μεμβρανών-κυτταρικών τοιχωμάτων, αφετέρου έδειξαν πως η δραστικότητα του ενζύμου στα φύλλα της πενίας άνθρακα ήταν 2 με 3 φορές υψηλότερη από ό,τι στα φύλλα control.
Στους ίδιους χειρισμούς πραγματοποιήθηκε ιστοχημικός εντοπισμός των ελέυθερων κατίοντων ασβεστίου. Το ασβέστιο, τόσο στο περδικάκι όσο και στο βλήτο, εντοπίστηκε στους ιδιοβλάστες και στα γειτονικά τους κύτταρα. Στο περδικάκι χρώση εμφανίστηκε και στους δύο χειρισμούς, ενώ αντιθέτως στο βλήτο μόνο στα φυτά της πενίας άνθρακα.
Στα φύλλα της αμπέλου πραγματοποιήθηκε ανάλυση SDS-PAGE στο matrix που περιβάλλει τις ραφίδες. Ανιχνεύτηκαν πρωτεΐνες που πιθανόν να παίζουν ρόλο στη διαχείριση του ασβεστίου, χωρίς ωστόσο να είναι γνωστή η ταυτότητά τους.
Συνοψίζοντας, το μέγεθος των κυτταρικών εγκλείστων μεταβάλλεται σε συνθήκες πενίας άνθρακα. Για τον έλεγχο του βαθμού στον οποίο συμβάλλουν στη φωτοσύνθεση πραγματοποιήθηκε, και στα τρία φυτικά είδη, μέτρηση των παραμέτρων της φωτοσύνθεσης με τη χρήση φθορισμομετρίας της χλωροφύλλης σε μεταβαλλόμενες συνθήκες φωτισμού και σύστασης της ατμόσφαιρας, τόσο σε φύλλα control όσο και σε φύλλα πενίας άνθρακα. Από τα αποτελέσματα προέκυψε πως αφενός τα φύλλα της πενίας άνθρακα διατηρούν έναν ικανοποιητικό φωτοσυνθετικό ρυθμό ακόμα και στις συνθήκες αυτές, αφετέρου, όταν παύσουν οι συνθήκες που προκαλούν την πενία άνθρακα, είναι σε θέση να αποκτήσουν υψηλό ρυθμό φωτοσυνθετικής δραστηριότητας πολύ συντομότερα από ότι τα control φύλλα.
Υπάρχουν συνεπώς σαφείς ενδείξεις πως τα κυτταρικά έγκλειστα συμβάλλουν στη φωτοσυνθετική διαδικασία. Εκτιμάται πως στην περίπτωση του P. judaica οι κυστόλιθοι έχουν τη δυνατότητα να υποστηρίξουν ρυθμό φωτοσύνθεσης 14,27 μmol CO2 m-2 s-1 για 30 min περίπου, και στο A. hybridus ρυθμό φωτοσύνθεσης 13,01 μmol CO2 m-2 s-1 για 70 min.
Τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν την υπόθεση εργασίας για τη λειτουργία των κυτταρικών εγκλείστων ως αποθεμάτων φωτοσυνθετικού άνθρακα. Η λειτουργία αυτή θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως «φωτοσύνθεση κινδύνου» η οποία επάγεται από την πενία άνθρακα και είναι ζωτικής σημασίας για την επιβίωση σε συνθήκες έλλειψης νερού. Εκτός αυτού, η φωτοσύνθεση κινδύνου δίδει τη δυνατότητα ανάκτησης του CO2 το οποίο απελευθερώνεται μέσω της νυκτερινής αναπνοής (του υπέργειου, αλλά και του υπόγειου τμήματος του φυτού) και επομένως εξοικονομούνται σκελετοί άνθρακα. Αποτρέπει την άνοδο της συγκέντρωσης του CO2 σε τοξικά επίπεδα στα κύτταρα, τουλάχιστον στη διάρκεια της νύκτας, όταν τα στόματα παραμένουν κλειστά και δεν υπάρχει δυνατότητα φωτοσυνθετικής αφομοίωσης του εκλυόμενου αναπνευστικού CO2. Επίσης δίνει τη δυνατότητα τροφοδοσίας των φύλλων με ανόργανο άνθρακα από το υπόγειο τμήμα του φυτού ή από το έδαφος, με ενδιάμεσο σταθμό ελέγχου της διάθεσής του τα κύτταρα που σχηματίζουν τους κρυστάλλους.
This thesis focuses on the study of the structure and role of the idioblasts that produce calcium carbonate and calcium oxalate crystals in three plant species (Vitis vinifera, Amaranthus hybridus and Parietaria judaica) and their possible positive effect on photosynthetic activity. To-date there have been limited experimental data concerning their role in plant physiology. Some of the physiological roles attributed to them include calcium storage and calcium tissue concentration adjustment, plant protection against herbivorous animals and chewing insects, and the sequestretion of excess heavy metal ions by means of crystal binding. Recent data of our research team have shown that the calcium carbonate and calcium oxalate crystals constitute dynamic systems rather than end-products of plant metabolism. Therefore, it is proposed that calcium carbonate and calcium oxalate crystals may constitute carbon rather than calcium deposits in plants and that they may provide CO2 to the continuation of photosynthesis during carbon starvation conditions (“alarm photosynthesis”). It is also proposed that these crystals are formed during the early stages of leaf development when the stomata are not functional.
In this context, an experiment was designed for all three species during which leaves of different ages (as it was expressed by their surface area) were collected and the values of the parameters: photosynthetic rate, transpiration rate, substomatal CO¬2 concentration, stomatal conductance, crystal density and total crystals per leaf were measured and correlated. The results showed that the crystals are formed during the first stages of leaf development. At this stage, their density is high but it reduces by leaf age and stabilizes to a specific value. Total crystal number per leaf follows the opposite course, as it is low at first and then increases by leaf age until it stabilizes to a specific value. At the same time, it was shown that even young leaves demonstrate low photosynthetic rate even though their stomata are not functional and are therefore unable to allow gas exchange with the atmosphere.
In another experiment, the effect of carbon starvation on crystal size was tested in leaves of plants of P. judaica and A. hybridus. Carbon starvation conditions occur in planta when stomata remain closed due to water stress or the occurrence of high wind speed. The leaves were categorized into two groups: control leaves and leaves that remained under carbon starvation conditions (by imposing water stress, by applying ABA, and by allowing to photosynthesize in airtight chambers at the CO2 compensation point). After 24 and 48 hours under constant illumination crystal size was measured. The results showed that the group of leaves that were subjected to the carbon starvation conditions contained crystals of significantly smaller size than the control leaves (50-60% smaller). The addition of carbonates in the nutrient solution of carbon starvation treated leaves of P. judaica led to a complete reversal of the phenomena as the crystal size regained its pre-treatment size.
Calcium carbonate is freely dissolved in aqueous solutions. Oxalic acid, however, is considered to be oxidized to CO2 and H2O2 by the effect of the enzyme oxalic oxidase. In order to verify this assumption an experiment of oxalic oxidase and catalase histochemical detection in control and carbon starvation treated leaves of A. hybriduswas designed. Oxalic oxidase was detected in the membranes or cell wall of the spongy cells. Furthermore, no staining appeared in the bundle sheath cells in any case. Catalase staining gave similar results. Oxalic oxidase specific activity was measured by means of enzymic assay. The results on one hand, confirmed the histochemical detection results (only the cell membrane and cell wall fraction of the leaf extract showed activity of the enzyme), and on the other hand showed that the enzyme’s specific activity was 2 to 3 times higher in carbon starvation treated leaves than in control leaves.
An experiment of histochemical detection of free calcium cationswas performed to control and carbon starvation treated leaves of P. judaicaand A. hybridus. The results showed that free calcium cations are present to the idioblasts and some of the surrounding cells in both species. In P. judaica the staining solution reacted in both treatments. In A. hybridus, however, only the carbon starvation treated leaves were stained.
An SDS-PAGE analysis of the matrix that envelops the rafide crystals of V. vinifera, led to the detection of a number of proteins of variable molecular weights. These proteins may be involved with calcium management, their identity however remains unknown.
To sum up then, carbon starvation leads to the alteration of the size of the calcium carbonate and calcium oxalate crystals. The chlorophyll fluorescence parameters of control and carbon starvation treated leaves under various lighting conditions and atmospheric composition, of all three species, were measured in order to test the assumption that these crystal contribute to the photosynthesis. The results showed that carbon starvation treated leaves, are not only able to maintain a considerable photosynthetic rate even under these conditions, but also have the capacity to regain high photosynthetic rate when the carbon starvation conditions are lifted faster than the control leaves.
Consequently, there are many indications that calcium carbonate and calcium oxalate crystals contribute to the photosynthetic procedure. It is estimated that, in the case of P. judaica, the cystoliths are able to support a mean photosynthetic rate of 14,27 μmol m-2 s-1 for 30 min, and in the case of A. hybridus a mean photosynthetic rate of 13,01 μmol m-2 s-1 for 70 min.
Combined, the results of the experiments confirmed our initial working hypothesis that the calcium carbonate and calcium oxalate crystals can provide the substrate for the photosynthetic carbon fixation under adverse conditions. This function could be described as an “alarm photosynthesis” biochemical path and is vital for the survival of the plants under water stress conditions. Moreover, it enables the use of CO2 that is released through dark respiration, thus avoiding carbon losses, while preventing the increase in the CO2 concentration at toxic levels inside the cells. Finally, it enables the supply of the leaves with inorganic carbon from the root and the soil, using the cells in which the calcium oxalate crystals are formed as an intermediate control node.
