Σύνθεση και μελέτη νέων αναστολέων ενδοκυτταρικών φωσφολιπασών Α2 με πιθανή αντιφλεγμονώδη και αντικαρκινική δράση

Abstract

Οι φωσφολιπάσες Α2 είναι ένζυμα που υδρολύουν τον εστερικό sn-2 δεσμό των φωσφολιπιδίων της κυτταρικής μεμβράνης. Αποτέλεσμα της υδρόλυσης αυτής είναι η απελευθέρωση ελεύθερων λιπαρών οξέων και λυσοφωσφολιπιδίων, προϊόντα που αποτελούν πρόδρομες ενώσεις εικοσανοειδών και άλλων βιοδραστικών μορίων. Τα εικοσανοειδή, δηλαδή τα λευκοτριένια, τα θρομβοξάνια και οι προσταγλανδίνες συμμετέχουν σε πληθώρα φυσιολογικών λειτουργιών του κυττάρου μεταξύ των οποίων και η δημιουργία φλεγμονής που σε παθολογικές καταστάσεις συνδέεται με ασθένειες όπως ο καρκίνος, τα αυτοάνοσα νοσήματα και οι καρδιακές διαταραχές. Τα λυσοφωσφολιπίδια αποτελούν πρόδρομες ενώσεις του παράγοντα ενεργοποίησης αιμοπεταλίων (PAF) ο οποίος εμπλέκεται ιδιαίτερα στη φλεγμονή ενώ τα ίδια ενεργοποιούν τα λευκοκύτταρα του αίματος και μπορούν σε υψηλές συγκεντρώσεις να προκαλέσουν ιστικές βλάβες, γαστρικό έλκος, καρκινικό πολλαπλασιασμό και μεταστάσεις. Επομένως, τα ένζυμα αυτά αποτελούν ενδιαφέροντες φαρμακευτικούς στόχους και η σύνθεση νέων ισχυρών αναστολέων τους μπορεί να οδηγήσει σε νέα φάρμακα για την καταπολέμηση ποικίλων σύγχρονων ασθενειών όπως η σκλήρυνση κατά πλάκας και ο καρκίνος. Η υπεροικογένεια των φωσφολιπασών αποτελείται από πέντε κύριες ομάδες: τις εκκρινόμενες PLA2, τις κυτοσολικές, τις ανεξάρτητες ιόντων ασβεστίου, τις ακετυλοϋδρολάσες του PAF και τη λυσοσωμική PLA2. Η GIVA cPLA2 και η GVIA iPLA2 είναι τα περισσότερο μελετημένα ένζυμα της οικογένειας αυτής και έχουν συνδεθεί με την ανάπτυξη και εξέλιξη πληθώρας ασθενειών. Η cPLA2 είναι ένα κυτοσολικό ένζυμο βάρους 85 kDa με εξειδίκευση στα φωσφολιπιδικά υποστρώματα που περιέχουν το αραχιδονικό οξύ. Το ενεργό της κέντρο εμπεριέχει την καταλυτική δυάδα Ser/Asp ενώ η δράση της ρυθμίζεται από την παρουσία ιόντων Ca2+. Το ένζυμο αυτό έχει βρεθεί να παίζει ρόλο στην παθοφυσιολογία ασθενειών του εγκεφάλου (Πάρκινσον), του νευρικού συστήματος (σκλήρυνση κατά πλάκας) και στον καρκίνο. Από την άλλη πλευρά, η iPLA2 αποτελείται από 2 κύριες ισομορφές μοριακού βάρους 85-90 kDa και το ενεργό της κέντρο είναι τύπου λιπάσης Gly-X-Ser-X-Gly. Η ρύθμιση του ενζύμου είναι ανεξάρτητη των ιόντων ασβεστίου και πραγματοποιείται είτε μέσω της δράσης του ενζύμου κασπάση-3 ή μέσω της πρόσδεσης ενός μορίου ΑΤΡ. Η iPLA2 παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές φυσιολογικές κυτταρικές λειτουργίες όπως η ανάπτυξη, ο πολλαπλασιασμός και η απόπτωση αλλά χαρακτηρίζεται κυρίως από την ιδιότητα να διατηρεί την ομοιόσταση της φωσφολιπιδικής μεμβράνης. Έχει συσχετιστεί με τη παθοφυσιολογία διαφόρων νοσημάτων όπως η σχιζοφρένεια, ο διαβήτης, η γένεση και η εξέλιξη του καρκίνου. Όλα αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ανάπτυξη αναστολέων έναντι των ενζύμων αυτών και ιδίως της iPLA2 αποτελεί σημαντικό ερευνητικό στόχο τόσο για την περαιτέρω διερεύνηση της δομής και της λειτουργίας του ενζύμου όσο και για την δημιουργία νέων φαρμακευτικών προϊόντων. Οπότε, στη βιβλιογραφία αναφέρεται πληθώρα αναστολέων της iPLA2 με τους σημαντικότερους και ισχυρότερους να είναι η βρωμοενολο-λακτόνη, οι τριφθορομέθυλο κετόνες, οι μέθυλο φθοροφωσφονικοί εστέρες, οι πολυφθοροκετόνες και τα 2-οξοαμιδικά παράγωγα. Η μελέτη της δραστικότητας των γνωστών αναστολέων της βιβλιογραφίας και η σχέση δομής-δράσης τους οδήγησε στο σχεδιασμό και τη σύνθεση 2-οξοαμιδικών παραγώγων και πολυφθοροκετονικών ενώσεων ως πιθανούς αναστολείς της ανεξάρτητης ιόντων ασβεστίου φωσφολιπάσης Α2. Στην παρούσα εργασία συντέθηκαν: 1) 2-Οξοαμιδικά παράγωγα που περιλαμβάνουν έναν παρα-μεθόξυ υποκατεστημένο αρωματικό πυρήνα σε απόσταση τεσσάρων ανθρακοατόμων από το ενεργοποιημένο καρβονύλιο ακολουθούμενο από ένα άμινο συστατικό το οποίο διαφοροποιείται σε κάθε παράγωγο. 2) Πολυφθοροκετονικές ενώσεις που περιλαμβάνουν έναν ετεροκυκλικό αρωματικό δακτύλιο, μια αλυσίδα τεσσάρων ανθρακοατόμων και το ενεργοποιημένο καρβονύλιο της πολυφθορομάδας. Η ενζυμική αποτίμηση των αναστολέων που παρασκευάστηκαν έναντι των φωσφολιπασών GIVA cPLA2, GVIA iPLA2 και GV sPLA2 πραγματοποιήθηκε σε in vitro πειράματα χρησιμοποιώντας την μέθοδο μικτών μικκυλίων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι πολύ καλή αναστολή και καλή εκλεκτικότητα ως προς την iPLA2 έδειξαν τα 2-οξοαμιδικά παράγωγα που περιείχαν το διπεπτίδιο νορλευκίνη – γλυκίνη και tert-βουτυλεστέρα ή βενζυλεστέρα και αυτό που περιείχε το διπεπτίδιο λευκίνης – γλυκίνης και tert-βουτυλεστέρα ενώ τη μέγιστη αναστολή την παρουσίασε το 2-οξοαμίδιο που περιείχε το διπεπτίδιο γλυκίνης – γ-αμινοβουτυρικού οξέος με τον tert-βουτυλεστέρα με 99.9% αναστολή και ΧΙ (50)= 0.007. Οι πολυφθοροκετονικές ενώσεις γενικά έδειξαν χαμηλή έως μέτρια αναστολή με την ισχυρότερη αναστολή ως προς την iPLA2 να την παρουσιάζει η πενταφθοροαιθυλο-κετόνη που περιείχε το μεθυλο-προστατευμένο ινδόλιο και μια αλυσίδα τεσσάρων ανθρακοατόμων με 93%.

Phospholipases A2 are enzymes that hydrolyze the sn-2 ester bond of the cellular membrane’s phospholipids. This hydrolysis has as a result the release of free fatty acids and lysophospholipids, precursors of eicosanoids and other bioactive molecules. Eicosanoids, as are leukotriens, thromboxans and prostaglandins participate in a plethora of normal functions in the cell among which is the creation of inflammation that in pathological conditions is associated to illnesses such as cancer, autoimmune diseases and cardiac disorders. Lysophospholipids are precursors of the platelet-activating factor (PAF) which is involved in inflammation while lysophospholipids themselves activate blood leukocytes and in high concentrations may cause tissue damage, gastric ulcer, tumor proliferation and metastasis. Therefore, these enzymes constitute interesting pharmaceutical targets and synthesis of new potent inhibitors can lead to novel drugs for the cure of contemporary diseases such as multiple sclerosis and cancer. The superfamily of phospholipases consists of five main groups: the secreted PLA2, the cytosolic, the Ca2+-independent, PAF-acetylhydrolases and the lysosomal PLA2. GIVA cPLA2 and GVIA iPLA2 are the most studied enzymes of this family and have been associated with the development and progression of multiple diseases. cPLA2 is a cytosolic enzyme of 85 kDa with specificity towards phospholipid substrates that contain arachidonic acid. Its active center contains the catalytic dyad Ser/Asp while its action is regulated by the presence of Ca2+ ions. This enzyme has been found to play a role in the pathophysiology of brain diseases (Parkinson), disorders of the nervous system (multiple sclerosis) and in cancer. On the other hand, iPLA2 consists of two isoforms weighted 85-90 kDa and its active center is a lipase type Gly-X-Ser-X-Gly. Regulation of this enzyme is independent of calcium ions and it takes place either through the activity of enzyme caspace-3 or through the attachment of an ATP molecule. iPLA2 has a great part in many physiological cellular functions as are the growth, the proliferation and the apoptosis but mostly is characterized by its ability to maintain the homeostasis of the phospholipid membrane. It has been associated with the pathophysiology of various diseases such as schizophrenia, diabetes, genesis and progression of cancer. All these data suggest that the development of inhibitors of these enzymes and mostly of iPLA2 is an important research target for both further investigation of the structure and function of the enzyme and the creation of new medicines. Thus, a plethora of inhibitors of iPLA2 is reported in the literature and the most important and potent are bromoenol-lactone, trifluoromethyl ketones, methyl fluorophosphonic esters, polyfluoroketones and 2-oxoamides. Studying of the activity of known inhibitors in the literature and their structure-activity relationship led to the design and synthesis of 2-oxoamide derivatives and polyfluoroketone compounds as possible inhibitors of the Ca2+-independent phospholipase A2. In the present work the following were synthesized: 1) 2-Oxoamide derivatives that contain a para-methoxy substituted aromatic core in a distance of four carbon atoms from the activated carbonyl followed by an amino component which differentiates in each derivative. 2) Polyfluoroketone compounds that contain a heterocyclic aromatic ring, a chain of four carbon atoms and the activated carbonyl of the polyfluorogroup. The enzymatic assays of the inhibitors prepared against phospholipases GIVA cPLA2, GVIA iPLA2 and GV sPLA2 were performed in in vitro experiments using the method of mixed micelles. The results showed that 2-oxoamides which presented very good inhibition and good selectivity are those that contained dipeptide norleukine – glycine and a tert-butylester or a benzylester and the one which contained dipeptide leukine – glycine and a tert-butylester which the greatest inhibition showed the 2-oxoamide that contained dipeptide glycine – γ-aminobutyric acid with the tert-butylester by 99.9% and ΧΙ (50)= 0.007. Generally, polyfluoroketones showed low to medium inhibition towards iPLA2. Pentafluoroethyl-ketone containing a methyl-protected indole and a four-carbon chain presented the highest inhibition of 93%.