Μελέτη της επίδρασης ουσιών με μυκητοκτόνο-κυτταροτοξική δράση σε κυτταρικούς πληθυσμούς με εξειδικευμένα χαρακτηριστικά μέσω μετά-μεταγραφικής τροποποίησης αυτών για χρήση σε βιοαισθητήρες

Abstract

Ο όρος οξειδωτικό στρες αναφέρεται στην κατάσταση, κατά την οποία η ισορροπία ανάμεσα στους οξειδωτικούς παράγοντες και την αντιοξειδωτική άμυνα ενός οργανισμού διαταράσσεται σημαντικά υπέρ των πρώτων, οδηγώντας έτσι στη βλάβη των κυτταρικών συστατικών. Οι ελεύθερες ρίζες και οι ενεργές μορφές οξυγόνου είναι δραστικές ενώσεις που παράγονται φυσικά και μπορούν να ασκήσουν τόσο θετικές όσο και αρνητικές επιπτώσεις στα βιολογικά συστήματα. Για τον περιορισμό των επιβλαβών επιπτώσεων, οι οργανισμοί διαθέτουν πολύπλοκα συστήματα προστασίας, τα αντιοξειδωτικά συστήματα. Αυτά τα συστήματα αποτελούνται από αντιοξειδωτικά ένζυμα (CAT, GPx, SOD) και από μη-ενζυμικά αντιοξειδωτικά. Η διαταραχή μεταξύ της παραγωγής ελευθέρων ριζών και της αντιοξειδωτικής άμυνας οδηγεί σε μία οξειδωτική κατάσταση, που εμπλέκεται στη διαδικασία της γήρανσης και σε παθολογικές καταστάσεις (π.χ. καρκίνος, ασθένεια Parkinson). Τα τελευταία χρόνια το ξενοβιοτικά-επαγώμενο οξειδωτικό στρες, ως μηχανισμός τοξικότητας, έχει γίνει αντικείμενο εκτεταμένης μελέτης. Η παρούσα εργασία εστίασε σε μια σχετικά νέα κατηγορία ξενοβιοτικών ουσιών, τις στρομπιλουρίνες, οι οποίες δρουν ως παρεμποδιστές της κυτταρικής αναπνοής, διαταράσσοντας την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων στα μιτοχόνδια. Ο μηχανισμός δράσης των στρομπιλουρινών, ο οποίος συνδέεται άμεσα με την παραγωγή ROS από τα μιτοχόνδρια, καθιστά απαραίτητη τη μελέτη της επίδρασης τους στην οξειδωτική ισορροπία των κυττάρων. Για το σκοπό αυτό εκτιμήθηκε η επίδραση του kresoxim-methyl, μιας από τις πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενες στρομπιλουρίνες παγκοσμίως, στην οξειδωτική ομοιόσταση κυττάρων θηλαστικών. Η έκθεση του μυκητοκτόνο πραγματοποιήθηκε σε μη θανατηφόρες δόσεις, οι οποίες συμπίπτουν και με τα μεγίστα επιτρεπτά όρια (MRLs) που έχουν θεσπιστεί για την υπολειμματικότητα του σε αγροτικά προιόντα. Οι κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν ήταν τα κύτταρα νευροβλαστώματος N2a και οι νεφρικοί ινοβλαστες Vero, ενώ διενεργήθηκαν πειράματα κυτταρικής βιωσιμότητας και μετρήθηκαν μια σειρά από ενζυμικοί και μη-ενζυμικοί μηχανισμοί, που εμπλέκονται στις αντιδράσεις οξειδωτικού στρες και απόπτωσης. Οι δύο κυτταρικές σειρές αν και εμφάνισαν παρόμοια αποτελέσματα βιωσιμότητας έναντι του μυκητοκτόνου, έδωσαν διαφορετικές αντιδράσεις σε ότι αφορά την οξειδοαναγωγική τους ισορροπία.Επιπλέον κατασκευάστηκε κυτταρικός βιοαισθητήρας που βασίστηκε στην καλλιέργεια κυττάρων στην επιφάνεια του βιοσυμβατού και αγώγιμου πολυμερούς PEDOT. Αρχικά εξετάστηκε η κυτταρική προσκόλληση και βιωσιμότητα των δύο κυτταρικών σειρών στο πολυμερές και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μελέτη ηλεκτροδίων PEDOT/κυττάρων μέσω ηλεκτροχημικών μεθόδων. Τέλος έγινε προσπάθεια βελτίωσης της ευαισθησίας του βιοαισθητήρα μέσω ελέγχου της έκφρασης αποτοξινωτικών και αντιοξειδωτικών γονιδίων των κυττάρων Vero. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε μετα-μεταγραφική σίγηση του παράγοντα Nrf2 μέσω παροδικής διαμόλυνσης και χρήση των τροποποιημένων κυττάρων ως βιολογικό στοιχείο αναγνώρισης του αισθητήρα. Ο κυτταρικός βιοαισθητήρας εμφάνισε υψηλή συσχέτιση με τον αριθμό κυττάρων, αλλά και με την συγκέντρωση μυκητοκτόνου και αύξησε την ευαισθησία του μετά την εφαρμογή της μετα-μεταγραφικής σίγησης, καταδεικνύοντας τη σημασία του τροποποιημένου στοιχείου βιοαναγνώρισης.

Oxidative stress is defined as a disturbance in the balance between the production of reactive oxygen species (free radicals) and antioxidant defenses. Free radicals and reactive oxygen species are naturally occurring reactive compounds that exert both positive and negative effects. To counteract the harmful effects, organisms have developed complex defense mechanisms that constitute the antioxidant response mechanisms. These mechanisms include antioxidant enzymes (CAT, GPx, SOD) and non-enzymatic antioxidants (vitamin C, GSH). The imbalance between free radical production and antioxidant defenses leads an oxidative state, which is associated with the process of aging and with pathological conditions such as cancer and Parkinson's disease. In recent years, xenobiotics-induced oxidative stress as a mechanism of toxicity has been the subject of extensive research. The present study is focused on a relatively new class of xenobiotics, strobilurins, which act as inhibitors of cellular respiration, disrupting the electron transport chain in mitochondria. Their mode of action, which is directly linked to ROS production in mitochondria, makes it necessary to study their effect on the oxidative imbalance of mammalian cells. For this purpose, we studied the effect of kresoxim-methyl, one of the most widely used strobilurin fungicides, on the oxidative homeostasis in mammalian cells. Cells were exposed to non-lethal doses of the fungicide, which coincide with the maximum residue levels (MRLs) established for kresoxim-methyl in agricultural commodities. The cell lines used in our study were N2a neuroblastoma cells and Vero renal fibroblasts. The effects of the fungicide were assessed through cell viability tests and a series of enzymatic and non-enzymatic markers of oxidative stress response and apoptosis. Both cell lines showed similar viability results against the fungicide, but responded differently in terms of redox status. Furthermore, a cell-based biosensor was constructed, through the culture of mammalian cells on the surface of the biocompatible and conductive polymer PEDOT. Cellular adhesion and viability of both cell lines on PEDOT were examined, followed by electrochemical studies of the electrode-cell configuration. Finally, Vero cells were subjected to post translational modifications by silencing transcription factor Nrf2. This attempt aimed to improve the sensitivity of the biosensor by controlling the expression of the detoxifying and antioxidant genes of Vero cells, which acted as the biorecognition element. The response of the cell biosensor was highly correlated with the number of cells and with the fungicide concentration. The modified biosensor also exhibited increased sensitivity after application of post-transcriptional silencing to the biorecognition element.