Χαρακτηρισμός και βιοχημικός ρόλος των γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό του άνθρακα στα φυμάτια του Lotus japonicus

Abstract

Η συμβιωτική αζωτοδέσμευση περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση των ψυχανθών με βακτήρια του εδάφους που ονομάζονται ριζόβια. Η αλληλεπίδραση αυτή καταλήγει στο σχηματισμό ενός νέου φυτικού οργάνου, του φυματίου. Κατά τη διαδικασία της αζωτοδέσμευσης συμβαίνουν πολλές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση και στη συσσώρευση μεταβολιτών τόσο στα ριζόβια όσο και στο φυτό-ξενιστή. Σε μια προσπάθεια να μελετηθούν οι συνολικές αλλαγές που συμβαίνουν στο μεταβολισμό κατά την ανάπτυξη του φυματίου, χρησιμοποιήθηκε μια πλατφόρμα βασιζόμενη στην τεχνική ποσοτικού (RT)-PCR για τη μελέτη της μεταγραφικής ρύθμισης γονιδίων του πρωτογενούς και δευτερογενούς μεταβολισμού του Lotus japonicus, ενώ για την ανάλυση των μεταβολιτών αναπτύχθηκε μια πλατφόρμα βασιζόμενη στην τεχνική GC-MS. Τόσο η μεταγραφή των γονιδίων όσο και η συσσώρευση μεταβολιτών μελετήθηκαν σε φυτά L. japonicus που είχαν υποστεί παρατεταμένο σκοτάδι για 24 και 72 ώρες. Η έλλειψη φωτοσυνθετικού άνθρακα που προκλήθηκε από το παρατεταμένο σκοτάδι είχε ως αποτέλεσμα αλλαγές τόσο στη συσσώρευση των μεταγραφημάτων των γονιδίων όσο και στη συσσώρευση μεταβολιτών. Τα μεταγραφικά επίπεδα των περισσοτέρων γονιδίων που μελετήθηκαν μειώθηκαν κατά τη διάρκεια της σκοτεινής περιόδου, και ιδιαίτερα, μετά από 72 ώρες συνεχούς σκότους. Τα επίπεδα των μεταβολιτών είτε ήταν μειωμένα είτε δεν παρουσίασαν διαφορά. Εξαίρεση αποτέλεσε η μεγάλη συσσώρευση αμινοξέων, δηλώνοντας πιθανή αποδόμηση των πρωτεϊνών στις συνθήκες αυτές. Η έλλειψη άνθρακα επηρέασε πολλές μεταβολικές διαδικασίες του φυματίου, περιλαμβάνοντας σύνθεση αμύλου, γλυκόλυση, δέσμευση CO και αφομοίωση αζώτου. Η ταυτόχρονη μείωση των μεταβολικών μονοπατιών της γλυκόλυσης και της δέσμευσης CO είχε ως αποτέλεσμα την έλλειψη σε σκελετούς άνθρακα και ιδιαίτερα την έλλειψη μηλικού οξέως, που θεωρείται η κύρια πηγή άνθρακα για το μεταβολισμό των βακτηριοειδών και την αζωτοδέσμευση. Τα πολύ αυξημένα επίπεδα έκφρασης ενός γονιδίου που κωδικοποιεί για NADH-εξαρτώμενη αφυδρογονάση του γλουταμινικού είναι πιθανό να 2 χρειάζονται για την αποδόμηση των αμινοξέων με σκοπό να παρέχονται σκελετοί άνθρακα στην αναπνευστική οδό, λειτουργώντας ως μια εναλλακτική πηγή ενέργειας. Ένα από τα τελικά προϊόντα του μεταβολισμού του άνθρακα είναι το CO , το οποίο παρουσιάζει υψηλή συσσώρευση στα φυμάτια. Η καρβονική ανυδράση (CA, EC 4.2.1.1) αποτελεί ένζυμο-«κλειδί» στο μεταβολισμό του CO καθώς καταλύει την αμφίδρομη αντίδραση ενυδάτωσής του παράγοντας HCO 3 - 2 . Οι καρβονικές ανυδράσες είναι άφθονα στη φύση ένζυμα, που βρίσκονται σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς και συμμετέχουν σε πλήθος φυσιολογικών και βιοχημικών διαδικασιών. In silico ανάλυση των ESTs του L. japonicus αποκάλυψε την ύπαρξη δύο cDNA κλώνων, που ονομάστηκαν Ljcaα1 και Ljcaα2, 2 2 και κωδικοποιούν για α-τύπου καρβονικές ανυδράσες όμοιες με τους α-τύπου ισομόρφους των θυλαστικών. Ένα άλλο γονίδιο, το Ljca1, που κωδικοποιεί για μια β-τύπου CA μελετήθηκε επίσης. Η λειτουργικότητα των πολυπεπτιδίων που κωδικοποιούν τα γονίδια αυτά, επιβεβαιώθηκε με βιοχημικές δοκιμές, χρησιμοποιώντας μια μέθοδο που βασίζεται σε μετρήσεις στην αλλαγή του pH κατά τη διάρκεια της βιοχημικής αντίδρασης με τη χρήση μιας χρωμοφόρου ουσίας. Η έκφραση των γονιδίων μελετήθηκε με τη μέθοδο ποσοτικού (RT)-PCR τόσο σε συμβιωτικούς όσο και σε μη συμβιωτικούς ιστούς, και βρέθηκε οτι τα γονίδια κωδικοποιούν για ισοτύπους με ενισχυμένη έκφραση στα φυμάτια. Η έκφραση των Ljcaα1 και Ljcaα2 ήταν μέγιστη στα αρχικά στάδια ανάπτυξης του φυματίου, ενώ στα ώριμα φυμάτια τα επίπεδα έκφρασης μειώθηκαν. Τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης όλων των γονιδίων σε φυμάτια φυτών που είτε είχαν εμβολιαστεί με μεταλλαγμένα στελέχη Mesorhizobium loti είτε είχαν υποστεί συνθήκες εκτενούς σκότους, δηλώνουν τη συσχέτιση της έκφρασης των γονιδίων αυτών με τη λειτουργία του φυματίου και τη διαδικασία της αζωτοδέσμευσης. Ο χωροταξικός εντοπισμός των Ljcaα1 και Ljcaα2 ελέγθηκε με RNA-RNA in situ υβριδισμό και βρέθηκε πως και τα δύο γονίδια εντοπίζονται στα παρεγχυματικά κύτταρα, τις ηθμαγγειώδεις δεσμίδες και τον κεντρικό ιστό. Ο φυσιολογικός ρόλος των γονιδίων αυτών μελετήθηκε κατόπιν σίγησης των γονιδίων με τη χρήση της τεχνικής RNAi. Η μειωμένη δραστηριότητα νιτρογενάσης στις μεταλλαγμένες σειρές φυτών που τα γονίδια παρουσιάζουν σίγηση είναι ενδεικτική του σημαντικού ρόλου των καρβονικών ανυδρασών στη συμβιωτική αζωτοδέσμευση

Symbiotic nitrogen fixation (SNF) involves the complex interaction of legume plants with soil bacteria collectively called Rhizobia. This interaction results in the formation of a novel plant organ, the root nodule. During SNF many changes occur in gene expression and metabolite accumulation in both rhizobia and host plant. In an attempt to study global changes occurring during nodule development, a real-time reverse transcription (RT)-PCR based platform was developed for the transcript profiling of Lotus japonicus genes involved in primary and secondary metabolism in nodules, while, the metabolites where analysed with the use of a GC-MS based platform. Both gene transcript profiling and metabolite accumulation were studied in nodules of L. japonicus plants that had undergone extended dark for 24 and 72 hours. Photosynthetic carbon deficiency caused by prolonged darkness resulted in changes in both gene transcript level and metabolomic profile. Most genes analysed were down regulated during the dark period and especially after 72 hours of continuous darkness. Metabolite levels were found to be either decreased or unaltered. High accumulation of aminoacids was an exception, denoting possible protein degradation under such conditions. Carbon deficiency affected many metabolic processes in L. japonicus nodules, involving starch synthesis, glycolysis, carbon fixation and ammonium assimilation. Reduced glycolysis and carbon fixation result in deficiency of carbon skeletons and especially malate, which is likely to be the primary source of carbon for bacteroid metabolism and SNF. The up regulation of a gene coding for NADH-glutamate dehydrogenase is probably needed for aminoacid breakdown to supply carbon skeletons to the respiratory pathway, as an alternative carbon source. , which is highly accumulating in nodules. Carbonic Anhydrase (CA, EC 4.2.1.1) is a key enzyme in CO One of the final products of carbon metabolism is CO 2 metabolism as it catalyses CO 2 reversible hydration to HCO 3 - 2 . CAs are ubiquitous enzymes found in all kingdoms of life and they are known to participate in several physiological and biochemical processes. In silico analysis of L. japonicus ESTs revealed the existence of two cDNA clones, designed Ljcaα1 and Ljcaα2, coding for α-type CAs similar to the mammalian α-type isoforms. Another gene, Ljca1, coding for a β-type CA was also studied. Functionality of the encoded polypeptides was confirmed by biochemical assays using a dye indicator method. The temporal expression profiling of the genes was studied by real time qPCR in both symbiotic and non-symbiotic organs and revealed that the genes code for nodule enhanced carbonic anhydrase isoforms. Expression of both Ljcaα1 and Ljcaα2 genes was maximal at early stages of nodule development, while at later stages the levels of both transcripts declined. Reduced expression levels of all genes in nodules either inoculated with mutant Mesorhizobium loti strains or after extended dark period, collerate their expression with nodulation and nitrogen fixation. The spatial expression profiling of Ljcaα1 and Ljcaα2 genes was examined by RNA-RNA in situ hybridization and revealed that both genes were expressed in nodule inner cortical cells, vascular bundles, and central tissue. The physiological role of these genes was studied by loss-of-function studies, using RNAi mutants. The reduced nitrogenase activity in silenced mutant lines denotes the important role of CAs in symbiotic nitrogen fixation