Ανάπτυξη φωταυγών αυτοματοποιημένων μεθόδων αναλύσεως

Abstract

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφεται η ανάπτυξη αυτοματοποιημένων μεθόδων αναλύσεων, οι οποίες κάνουν χρήση της αναλυτικής τεχνικής FIA, μέσω της εφαρμογή της πάνω σε ιδιοκατασκευασμένους αναλυτές. Οι αναλυτές αυτοί κατασκευάστηκαν με τέτοιο τρόπο, ώστε να διευκολύνουν την ανίχνευση των υπό διερεύνηση μορίων, να παρέχουν τρόπο αυτόματου χειρισμού των αντιδραστηρίων και να επιτρέπουν και την επεξεργασία, παρουσίαση και αποθήκευση των ληφθέντων δεδομένων ανίχνευσης (σήματα που μεταδίδονται προς τους ανιχνευτές). Η διενέργεια των προαναφερθέντων διαδικασιών, που ουσιαστικά συνοψίζονται με την αναφορά των δύο παρακάτω όρων: Flow control (Έλεγχος της ροής λειτουργίας των αναλυτών) και Data Acquisition-Manipulation-Presentation (Διαδικασία λήψης και διαχείρισης δεδομένων ανίχνευσης), πραγματοποιείται με την βοήθεια δύο αυτοσχέδιων προγραμμάτων, συντεταγμένων σε προγραμματιστική γλώσσα Labview. Η κατασκευή αυτών των αναλυτών πραγματοποιήθηκε για να καλύψει επιστημονικά πεδία ευρέως φάσματος, όπως η ιατρική (1ος αναλυτής, για ανίχνευση H2O2 σε δείγματα εκπνεόμνου αέρα), το περιβάλλον (2ος αναλυτής, για έλεγχο δειγμάτων νερού για τοξικότητα) και τα τρόφιμα (3ος αναλυτής, για προσδιορισμό μεθυλεστέρων πηκτίνης). Με αυτόν τον τρόπο επιδεικνύεται σαφέστατα η ευκολία με την οποία μπορεί κάποιος να χρησιμοποιήσει την τεχνική FIA, για να αυτοματοποιήσει μεθόδους ανάλυσης, που τον αφορούν, αλλά ταυτόχρονα να επιτύχει και στόχους για: μείωση όγκου αντιδραστηρίων, ευκολότερο χειρισμό αντιδραστηρίων, σαφέστατο χρονισμό πραγματοποίησης αντιδράσεων, καθώς και για παρακολούθηση ασταθών προϊόντων (μέσω χρήσης της τεχνικής stop flow analysis – 2ος αναλυτής – κεφάλαιο 2). Στην διατριβή αυτή (κεφάλαιο 1), αναφέρονται μερικά βασικά στοιχεία για τον αυτοματισμό στο αναλυτικό εργαστήριο και τονίζονται τα σημεία εκείνα, που οδήγησαν σε όλο και μεγαλύτερη ανάγκη της επιστημονικής κοινότητας, για ανάπτυξη όλο και πιο αυτόματων μεθόδων ανάλυσης, αλλά και όλο και πιο εξειδικευμένων μεθόδων (εφαρμοζόμενων ανά περίπτωση). Στο ίδιο κεφάλαιο αναλύονται μερικά βασικά στοιχεία για τον αυτοματισμό συστημάτων ανάλυσης, όπως η κατηγοριοποίησή τους, καθώς και παραδείγματα σύγχρονων τάσεων στην αυτοματοποίηση των συστημάτων ανάλυσης. Στο κεφάλαιο 2, αναφέρονται μερικά θεωρητικά στοιχεία που ενδιαφέρουν την εν λόγω τεχνική. Τέτοια στοιχεία αφορούν σε: μια θεωρητική προσέγγιση της μεθόδου αυτής (με αναφορά στις παραμέτρους που την επηρεάζουν), τις τεχνικές αυτοματοποίησης, που προσφέρει αυτή η μέθοδος, οργανολογία που εμπλέκει και προοπτικές που δημιουργεί. Στα κεφάλαια 3-5, αναφέρονται αναλυτικά πληροφορίες για τον κάθε αναλυτή που κατασκευάστηκε. Πιο συγκεκριμένα, στο κεφάλαιο 3 αναπτύσσεται ο τρόπος κατασκευής ενός αυτοσχέδιου αναλυτή, για ανάλυση δειγμάτων εκπνεόμενου αέρα για H2O2, στο κεφάλαιο 4 αναπτύσσεται ο τρόπος κατασκευής ενός αυτοσχέδιου αναλυτή, για ανάλυση δειγμάτων νερού για τοξικότητα και στο κεφάλαιο 5 αναπτύσσεται ο τρόπος κατασκευής ενός αυτοσχέδιου αναλυτή, για προσδιορισμό μεθυλεστέρων σε δείγματα πηκτίνης. Για τον κάθε αναλυτή αναφέρονται χρήσιμα στοιχεία που περιγράφουν αναλυτικά την κατασκευή του και η παρουσίαση αυτών των στοιχείων γίνεται με τον ακόλουθο τρόπο: α) Παράθεση ενδεικτικού σχεδιαγράμματος του αναλυτή FIA και σύντομη περιγραφή λειτουργίας του, β) Αναλυτική περιγραφή του κάθε στοιχείου υλικού, με παράθεση περιγραφής του τρόπου λειτουργίας του και του τρόπου διασύνδεσής του με τα άλλα στοιχεία υλικού, που χρησιμοποιούνται, γ) Αναλυτική περιγραφή του αυτοσχέδιου προγράμματος που χρησιμοποιείται σε κάθε αναλυτή για την επιτέλεση των διαδικασιών της ροής του προγράμματος, ελέγχου και λήψης δεδομένων. Αυτό γίνεται με παράθεση καίριων κομματιών του κώδικα καθώς επίσης λογικών διαγραμμάτων ροής των προγραμμάτων, που περιγράφουν σαφέστατα τα βήματα, που ακολουθούνται για την αρμονική λειτουργία του αναλυτή. Αξιοσημείωτη είναι και η παράθεση πολλών σχεδιαγραμμάτων και εικόνων, σε κάθε σημείο του σταδίου αυτού, για καλύτερη οπτική απεικόνιση του κάθε στοιχείου υλικού που χρησιμοποιείται. Με τον τρόπο αυτό μπορεί κάποιος να κατανοήσει καλύτερα και τον τρόπο συνδυασμού των στοιχείων υλικού, προς την κατεύθυνση απόδοσης ενός αναλυτή. Το κεφάλαια 3-5, παρουσιάζουν και τις μεθόδους που εφαρμόστηκαν σε κάθε αναλυτή, για να πιστοποιηθεί η εύρυθμη λειτουργία, κατά τους προσδιορισμούς στους οποίους χρησιμοποιήθηκαν. Από αυτές τις μεθόδους μας ενδιαφέρει η αναφορά της 1ης μεθόδου (που εφαρμόστηκε στον πρώτο αναλυτή), γιατί οι έτερες μέθοδοι (που εφαρμόστηκαν στους αναλυτές 2 & 3) αναπτύχθηκαν από έτερους υποψήφιους διδάκτορες που αναφέρονται στην εισαγωγή της διατριβής. Η πρώτη μέθοδος στοχεύει στην ανίχνευση H2O2 σε δείγματα εκπνεόμενου αέρα από ασθενείς, που πάσχουν από πνευμονολογικές παθήσεις. Η ανάγκη μέτρησης του υπεροξειδίου του υδρογόνου οφείλεται στο ότι αυτό είναι άριστος δείκτης, που παρέχει κλινικές πληροφορίες, σε σχέση με φλεγμονώδεις καταστάσεις στους πνεύμονες ασθενών. Και αυτό, γιατί μπορεί να συνδεθεί άμεσα με την ύπαρξη οξειδωτικού στρες στο ανθρώπινο σώμα. Αυτό το γεγονός εξηγεί την ύπαρξη πολλών μεθόδων που υπάρχουν στην βιβλιογραφία για την ανίχνευση υπεροξειδίου του υδρογόνου σε τέτοια δείγματα. Το πρόβλημα όμως των προϋπαρχόντων μεθόδων είναι ότι είναι μη αυτοματοποιημένες, χρονοβόρες και δύσκολες στην εκτέλεση. Επίσης συνήθως δεν διαθέτουν φορητές συσκευές για δειγματοληψία. Για να αντιμετωπιστούν τα παραπάνω μειονεκτήματα αναπτύχθηκε η εν λόγω 1η μέθοδος, η οποία παρέχει φορητή συσκευή δειγματοληψίας δειγμάτων εκπνεόμενου αέρα από ασθενείς και εκτέλεση προσδιορισμού Η2Ο2, μέσω μιας πλήρως αυτοματοποιημένης FIA-χημειοφωταυγούς μεθόδου ανίχνευσης. Ο εν λόγω φορητός εξοπλισμός δειγματοληψίας παρέχει απόδοση συλλογής μεγαλύτερη από 86%, επιτρέποντας την συλλογή 2-3 mL δείγματος μέσα σε 20min. Η μέθοδος προσδιορισμού που αναπτύχθηκε, βασίζεται στην ανάμιξη ροής διαλύματος λουμινόλης (που χρησιμοποιείται σαν φορέας του δείγματος) με ροή διαλύματος κοβαλτίου (II), η οποία παράγει ένα χημειοφωταυγές παράγωγο, το οποίο δίνει φως, με ένταση ανάλογη της συγκέντρωσης υπεροξειδίου του υδρογόνου. Ο αναλυτής παρέχει όριο ανίχνευσης 10 nM και καλή γραμμικότητα (R=0,997). Η επαναληπτικότητα που αποδίδει είναι καλύτερη από 6,0% RSD και η ανάκτηση που εμφανίζει η μέθοδος είναι μεγαλύτερη από 64,9%. Η σύγκριση των αποτελεσμάτων αυτής της μεθόδου, με τα αποτελέσματα της πιο συχνά χρησιμοποιούμενης μεθόδου ανάλυσης Η2Ο2 σε τέτοια δείγματα, έδωσε ισοδύναμα αποτελέσματα (P>0,001, συντελεστή συσχέτισης με R=0,94). Έτσι η μέθοδος που προτείνεται προσφέρει πλήρη αυτοματισμό στον χειρισμό αντιδραστηρίων, μεγάλο ρυθμό επεξεργασίας δειγμάτων (περίπου 180 δείγματα ανά ώρα), χαμηλό όριο ανίχνευσης και δυνατότητα για εξέλιξη του εξοπλισμού ανάλυσης σε φορητό (εγγενές πλεονέκτημα της μεθόδου FIA – Δες θεωρία).

The current thesis describes three analyzers developed according to Flow Injection Analysis principles. These analyzers are built to accommodate: analyte detection, automated solution handling and appropriate editing, presentation and storage of data acquired. The carrying out of the aforementioned procedures, which can be described with the use of two words: Flow control (For checking of the analyzers’ functionalities) and Data Acquisition-Manipulation-Presentation, can be realized through the assistance of two self-written computer programs, under the help of the Labview programming language. The creation of these analyzers aimed in covering a broad band of scientific fields spanning from medicine, through to the environment and food. This thesis shows three convenient systems for automation of wet chemistry analysis achieving small sample and reagent consumption, automated timing of analytical steps and monitoring of short lived unstable products through the stopped flow technique described in chapter 2. Introduction, in chapter 1, provides information concerning laboratory automation. The need and importance of laboratory automation are presented along basic terminology definitions, underlying the facts that led the scientific community to develop techniques for automated analysis and the reasons that made this effort so important. This chapter provides basic descriptions of automated analytical systems, schemes for their classification along with examples highlighting trends in automated methods of analysis. Chapter 2 presents theoretical aspects of the technique. The influence of fluidic parameters is described on a theoretical basis while automation modes are highlighted and selected applications are briefly described along instrumentation used. Εxperimental part presents information on the construction of three different alazyzers. 1st analyzer for detection of H2O2 in Exhaled Breath Condensate is described in chapter 3, 2nd analyzer for water toxicity assessment is described in chapter 4 while chapter 5 highlights the development of the 3rd analyzer for pectin methylesters determination. For each analyzer construction steps are shown together with schematic diagrams that offer information to the interested reader regarding their built up. To this end, there are detailed specifications of different components used in the three analyzers. For each of the three analyzers developed a schematic diagram is presented providing an overview of the construction and layout, then a detailed description of components used, alongside with capabilities offered, alongside with details on connection of different parts and functionalities offered. Following each diagram there is a detailed description of the software that has been developed for each analyzer, alongside with the functionalities offered concerning flow control, data acquisition and control, alongside with functions used for data extraction and utilization. Under this context, parts of programming code, together with logical flow diagrams, are given side by side, so as to clarify the steps that are followed, in order for the analyzer to function properly. Several sketches and pictures along these sections of the thesis are instrumental guiding to the reader to understand the systems proposed and providing details for implementation in his/her automation needs. Chapters 3-5, describing the analyzers developed, also contain information about the chemical methods that have been developed, in order for each analyzer to be tested for functionality and proofing that it covers the need that led to its creation. As far as these methods are concerned, a brief description is provided for just the first method (applied in the first analyzer), due to the fact that the other two methods (that have been tested in the other two analyzers) have been developed by other PhD students. As far as the first method is concerned, it was developed to determine Η2Ο2 in Exhaled Breath Condensate samples of patients that suffer from pulmonary diseases. The main reason that led to the need for the Η2Ο2 determination is the fact that Η2Ο2 is a perfect indicator of the existence of inflammation in the lungs. Hydrogen peroxide is created during any event of oxidative stress. This explains the existence of many chemical methods for determining Η2Ο2 in analogous samples. The problem with these methods is that they are not automated, they are tedious and laborious. Moreover, most of them do not offer portable equipment for sampling. Due to these drawbacks, we aimed at developing a method to overcome these problems and that would offer, not only a portable device for collecting such samples, but also offer a fully automated FIA-chemiluminescence method of analysis. The equipment that was constructed for collecting EBC offers a yield of more than 86%, allowing the acquisition of 2-3 mL of sample in just 20 min. The developed assay is based upon the mixing of a flowing stream of a Luminol solution (that contains the EBC sample) with a flowing stream of a Co (II) solution, which gives a chemiluminescent derivative, whose light is proportional to the H2O2 concentration. The analyzer offers a limit of detection of 10 nM and good linearity (R=0.997). The reproducibility of the method is better than 6.0% RSD and the recovery is better than 64.9%. The developed method compares well with the method commonly used in clinical chemistry: R=0.94, P>0.001. In summary, one can denote that the proposed method incorporates full automation, high speed of analysis (more than 180 samples per hour), low limit of detection and is a protoype that after further development, in collaboration with an instrument manufacturer, could lead to a fully functioning commercial product.