dc.contributor.advisor |
Κατινάκης, Παναγιώτης |
el |
dc.contributor.author |
Σκαγιά, Αγγελική Δ |
el |
dc.date.issued |
2016-03-15 |
|
dc.identifier.uri |
http://hdl.handle.net/10329/6382 |
|
dc.description.abstract |
Οι πεπτιδύλ-προλύλ cis/trans ισομεράσες (PPIάσες, EC: 5.2.1.8) αποτελούν μια υπεροικογένεια ενζύμων που καταλύουν την αργή διαδικασία της cis/trans ισομερίωσης των πεπτιδικών δεσμών που προηγούνται της προλίνης, σε διαφορετικά στάδια αναδίπλωσης των πρωτεϊνών στόχων, ως ένζυμα που βοηθούν την αναδίπλωση. Οι πεπτιδύλ-προλύλ cis/trans ισομεράσες, είναι ένζυμα που απαντώνται σε όλους τους οργανισμούς και σε όλα τα κυτταρικά διαμερίσματα. Τα μέλη της υπεροικογένειας των PPIασών διακρίνονται στις εξής οικογένειες: τις κυκλοφιλίνες (Cyclophilins), τις πρωτεΐνες που δεσμεύουν το FK506 (FKBPs) και τις παρβουλίνες (Parvulins). Οι τρεις οικογένειες PPIασών έχουν διακριτά υποστρώματα ενώ έχουν αποδειχθεί ευαίσθητες σε διαφορετικούς τύπους αναστολέων. Η πλειονότητα των PPIασών, εκτός από την ενεργότητα PPIάσης, εμφανίζουν και ενεργότητα τσαπερόνης μέσω της οποίας επιτελείται η αναδίπλωση πρωτεϊνών και παρεμποδίζεται η δημιουργία πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων. Επίσης, οι PPIάσες έχει βρεθεί ότι εμπλέκονται σε ένα μεγάλο αριθμό φυσιολογικών διεργασιών όπως είναι η απόκριση θερμικού στρες, η μεταγραφή και η μετάφραση, η μεταγωγή σήματος, η μετάσταση όγκου, η μολυσματικότητα παθογόνων, ο έλεγχος του κυτταρικού κύκλου και άλλα. Οι βακτηριακές PPIάσες ενώ δε φαίνεται να είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη υπό εργαστηριακές συνθήκες, έχουν σημαντικούς ρόλους στην επιβίωση σε ιδιαίτερες περιβαλλοντικές συνθήκες.
Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι ο βιοχημικός και μοριακός χαρακτηρισμός των μελών, δύο οικογενειών των PPIασών, των κυκλοφιλινών και των παρβουλινών, του μικροοργανισμού Escherichia coli. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε η ανάλυση του πλήρως αλληλουχημένου γονιδιώματος του βακτηρίου μέσω της οποίας εντοπίστηκαν τρία και δύο γονίδια αντίστοιχα, που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες που ανήκουν στις παρβουλίνες και στις κυκλοφιλίνες. Ο φυσιολογικός ρόλος των παρβουλινών και των κυκλοφιλινών μελετήθηκε μέσω της ανάπτυξης, σε διαφορετικές συνθήκες, των E. coli στελεχών ΔppiC, ΔsurA, ΔppiD, ΔppiB και ΔppiA στα οποία έχει απαλοιφθεί το συγκεκριμένο γονίδιο. Η απουσία κάποιων παρβουλινών και κυκλοφιλινών είχε ως αποτέλεσμα πλειοτροπικούς φαινοτύπους, οι οποίοι περιλαμβάνουν αυξημένη ικανότητα κολυμβητικής και επιφανειακής ομαδικής κίνησης, καθώς και αυξημένη ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου, συγκριτικά με το στέλεχος αγρίου τύπου.
Εξετάστηκε εάν η ενεργότητα PPIάσης αυτών των ενζύμων εμπλέκεται στους παρατηρούμενους φαινότυπους. Για αυτό το σκοπό, δημιουργήθηκαν στελέχη τα οποία φέρουν κατευθυνόμενες σημειακές μεταλλάξεις αμινοξέων που μετέχουν στον ενεργό κέντρο PPIάσης κάθε πρωτεΐνης (PpiBF99A, PpiBR43A, PpiAF128A, PpiCC41A) και ελέγχθηκε εάν αυτά τα στελέχη συμπληρώνουν τα αντίστοιχα μεταλλαγμένα στελέχη στην ομαδική και κολυμβητική κίνηση και στο σχηματισμό βιοϋμενίου. Η έκφραση των γονιδίων αγρίου τύπου αλλά και των μεταλλαγμένων γονιδίων των κυκλοφιλινών και των παρβουλινών στα αντίστοιχα μεταλλαγμένα στελέχη επανέφερε σε όλες τις περιπτώσεις τους φαινοτύπους του στελέχους αγρίου τύπου. Εξαίρεση αποτέλεσε το μεταλλαγμένο γονίδιο της κυκλοφιλίνης PpiBR43A, όπου δεν επανέφερε το φαινότυπο του σχηματισμού βιοϋμενίου, υποδηλώνοντας τη αναγκαιότητα της δραστικότητας ΡΡΙάσης της κυκλοφιλίνης σε αυτή τη συμπεριφορά.
Ο φαινότυπος των μεταλλαγμένων στελεχών ΔppiC, ΔsurA, ΔppiD, ΔppiB και ΔppiA επανήλθε στα επίπεδα αγρίου τύπου μέσω υπερέκφρασης της πλειοψηφίας των γονιδίων που κωδικοποιούν για τις PPIάσες του E. coli, υποδηλώνοντας ότι είναι δυνατή μια λειτουργική υποκατάσταση ανάμεσα στα μέλη της υπεροικογένειας των PPIασών.
Η αυξημένη ικανότητα ομαδικής, κολυμβητικής κίνησης και σχηματισμού βιοϋμενίου του στελέχους ΔppiB επανήλθε σε φυσιολογικά επίπεδα έπειτα από την υπερέκφραση πρωτεϊνών που αποτελούν πιθανούς στόχους της PpiB, των οποίων τα μεταλλαγμένα στελέχη σε αρκετές περιπτώσεις παρουσίασαν ανάλογους φαινότυπους με το στέλεχος ΔppiB. Επιβεβαιώθηκαν αρκετές αλληλεπιδράσεις των πιθανών πρωτεϊνών στόχων με την PpiB χρησιμοποιώντας διάφορες in vivo και in vitro μεθόδους αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών. Πολλές από αυτές τις αλληλεπιδράσεις εμπλέκουν το ενεργό κέντρο PPIάσης της, αφού με την παρουσία των πιθανών αυτών στόχων παρατηρήθηκε μείωση της in vitro ενεργότητας PPIάσης της κυκλοφιλίνης. Στην περίπτωση, των DnaK, AccC και PtA βρέθηκε ότι η κυκλοφιλίνη διαδραματίζει έναν ρόλο στον άμεσο λειτουργικό έλεγχο αυτών των πρωτεϊνών, αφού η παρουσία της αυξάνει την μετρούμενη ενζυμική ενεργότητα της καθεμίας πρωτεΐνης. Επίσης, η PpiB εμπλέκεται στον υποκυτταρικό εντοπισμό της DnaK ενώ φαίνεται ότι είναι υπεύθυνη για την ορθή αναδίπλωση της AccC.
Εξετάζοντας την κυτταρική μορφολογία των στελεχών που υπερεκφράζουν την κυκλοφιλίνη PpiB και την παρβουλίνη PpiC παρατηρήθηκε μια σημαντική κυτταρική επιμήκυνση, γεγονός που υποδηλώνει την εμπλοκή των παραπάνω ενζυμών στην κυτταρική διαίρεση. Αντίθετα, τα στελέχη τα οποία υπερεκφράζουν τα μεταλλαγμένα στο ενεργό κέντρο γονίδια, ppiBF99A, ppiBR43A και ppiCC41A, παρουσιάζουν κυτταρική μορφολογία όμοια με αυτή του αγρίου τύπου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ενεργότητα PPIάσης των δυο πρωτεϊνών είναι αναγκαία. Επιπλέον, οι δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με τις FtsZ και ZipA πρωτεΐνες της κυτταρικής διαίρεσης. Η παρουσία της PpiB μειώνει τη ενεργότητα GTPάσης της FtsZ και έχει αρνητική επίδραση στη σωστή τοποθέτησή της στις μελλοντικές θέσεις διαίρεσης. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν τη συμμετοχή των PpiB και PpiC στην κυτταρική διαίρεση μέσω της λειτουργικής τους συσχέτισης με πρωτεΐνες άμεσα εμπλεκόμενες σε αυτήν τη διαδικασία. |
el |
dc.description.abstract |
The peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPIases, EC 5.2.1.8) are enzymes that accelerate the slow
cis/trans isomerization of peptidyl-prolyl bonds in different folding states of a target protein, while, they
can also act on polypeptides, as folding helper enzymes. Prolyl isomerases are ubiquitous proteins, which
are found in all organisms and all cellular compartments. At least three different families, cyclophilins,
FK506-binding proteins (FKBPs) and parvulins constitute the enzyme class of PPIases. Additionally to the
proven isomerase function of the majority of PPIase family members, they also demonstrate chaperone
activity which allows them to prevent both newly synthesized polypeptide chains and assembled subunits
from aggregating into nonfunctional structures, inducing conformational changes in mature target proteins,
altering their structure and intermolecular interactions, thus affecting their activity. PPIases have been
found to take part in a great number of physiological processes such as heat shock response, transcription
and translation, signal transduction, tumor metastasis, pathogen virulence, cell cycle control and others.
Bacterial PPIases although appear to be non essential for growth under laboratory conditions they have
significant roles in survival in inviromental and pathogenic niches.
The main objective of the present study was to explore the biochemical and molecular function of the
Escherichia coli parvulins and cyclophilins. Our goal was initially addressed through the analysis of the
fully sequenced genome of E. coli, which revealed the existence of three and two members of the parvulins
and cyclophilins, respectively. The physiological role of parvulins and cyclophilins of E. coli was exploited
by examining the growth of strains ΔppiC, ΔsurA, ΔppiD, ΔppiB and ΔppiA, lacking each PPIase gene,
under various conditions. Characterization of parvulins and cyclophilins mutants revealed that the absence
some of these proteins resulted in pleiotropic phenotypes, including increased swarming and swimming
motility in addition to enhanced biofilm formation.
We asked whether the prolyl isomerase activity of these enzymes is involved in the observed
phenotypes. To this end, cyclophilin and parvulin proteins with PPIase active site mutations, (PpiB
,
PpiB
R43A
, PpiA
F128A
, PpiC
) were constructed by site-directed mutagenesis and tested whether the
resulting mutants complement the respective ΔppiB, ΔppiA and ΔppiC strains under swimming, swarming
and biofilm conditions. Complementation with cyclophilins and parvulins genes and also with the
respective PPIase-deficient genes, restored the motility and sessility phenotypes, suggesting that PPIase
activity seems to be unnecessary in these motile behaviors. The exception is PpiB
C41A
, where failed to
rescue the biofilm phenotype, suggesting the involvement of PPIase activity in this behavior.
R43A
Furthermore, since PPIases constitute three convergently evolved gene families, we attempted to clarify
the functional redundancy of the cyclophilins and parvulins with the other members of the three PPIases
families. Multi-copy suppressor screens demonstrated that the expression of the majority of PPIase
encoding genes restored swarming and swimming motility and biofilm formation of E. coli cyclophilins
and parvulins mutant strains.
Moreover, the motility and sessility phenotype of PpiB mutant strain was restored by over-expressing
several putative prey proteins which upon deletion are often characterized by analogous phenotypes. We
were able to verify several interactions through various in vivo and in vitro interaction screens. Many of the
interactions engage the PPIase active site, since in the presence of these putative prey proteins the in vitro
catalytic activity of the enzyme was diminished. Ιn the case of DnaK, AccC and Pta we also revealed a
direct role of PpiB in the functional control of these proteins since it increased the measured enzyme
activity of each protein and further interfered with DnaK localization and the correct folding of AccC.
F99A
Cells overexpressing ppiB and ppiC genes exhibited an elongated cell phenotype who failed to divide
normally, unlikely to cells overexpressing the respective PPIase-deficient genes, indicating that PPIase
activity of these proteins is affecting cell length. Additional, PpiB and PpiC are functionally associated
with cell division of E. coli, since the two proteins interact with FtsZ and ZipA, two cell division proteins
required for the formation of the Ζ ring. Furthermore, PpiB decreases the GTPase activity of FtsZ and
when overexpressed shows an inhibitory effect on ITS proper localization at future division sites. Taken
together, these results indicate that PpiB and PpiC are able to modulate bacterial cell division via its
functional association with proteins directly related to the process. |
en |
dc.language.iso |
el |
el |
dc.subject |
Cis/trans ισομερίωση |
el |
dc.subject |
Παρβουλίνες |
el |
dc.subject |
Κυκλοφιλίνες |
el |
dc.subject |
Ομαδική κίνηση σε επιφάνεια |
el |
dc.subject |
Κολυμβητική κίνηση |
el |
dc.subject |
Βιοϋμένιο |
el |
dc.title |
Μοριακή και βιοχημική ανάλυση των βακτηριακών παρβουλινών και κυκλοφιλινών |
el |
dc.type |
Διδακτορική εργασία |
el |
dc.contributor.department |
ΓΠΑ Τμήμα Επιστήμης Φυτικής Παραγωγής |
el |
dc.embargo.terms |
2019-01-01 |
|