Οργανιδιακή λειτουργικότητα και μοριακή διασταυροεπικοινωνία (cross-talk) στη σηματοδότηση της ανάπτυξης του Arabidopsis

Abstract

Τα υποκυτταρικά οργανίδια των ευκαρυωτικών κυττάρων κατέχουν πολύ σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό του κυττάρου. Στα μιτοχόνδρια, τους χλωροπλάστες και τα περοξυσώματα λαμβάνουν χώρα η αναπνοή, η φωτοσύνθεση και ο καταβολισμός των λιπαρών, αντίστοιχα, διεργασίες απαραίτητες για την επιβίωση των οργανισμών. Λόγω της αυξημένης μεταγωγής ενέργειας κατά τη λειτουργία των οργανιδίων, παράγονται Ενεργές Μορφές Οξυγόνου (ΕΜΟ), ως παραπροϊόντα του αερόβιου μεταβολισμού, οι οποίες είναι τοξικές για το κύτταρο, επιδρώντας αρνητικά στα βιομόρια του κυττάρου. Για την αντιμετώπιση των δυσμενών συνεπειών της δράσης των ΕΜΟ, τα κύτταρα έχουν αναπτύξει μηχανισμούς άμυνας έναντι της δράσης τους. Ο μηχανισμός ελέγχου της ποιότητας των πρωτεϊνών (Protein Quality Control, PQC) ανήκει σε αυτούς, και μέρος αυτού είναι η πρωτεάση Lon η οποία πρωτεολύει της οξειδωμένες από τις ΕΜΟ πρωτεΐνες, εμποδίζοντας έτσι το σχηματισμό τοξικών για το κύτταρο πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων. Η πρωτεάση Lon είναι προκαρυωτικής προέλευσης και απαντάται σε όλους τους οργανισμούς. Δυσλειτουργία της μιτοχονδριακής πρωτεάσης Lon διαταράσσει τη φυσιολογική μορφολογία και λειτουργία του οργανιδίου. Στα ζωικά μοντέλα σχετίζεται με μια πληθώρα νευροεκφυλιστικών ασθενειών και νεοπλασιών. Το φυτό A. thaliana έχει 4 γονίδια που κωδικοποιούν για ισομορφές της πρωτεάσης Lon. Μεταλλάγματα του γονιδίου Lon1 παρουσιάζουν ανωμαλίες στη μορφολογία των μιτοχονδρίων τους και μειωμένη αναπνευστική δραστηριότητα. Πρόσφατα βρέθηκε ότι η πρωτεάση Lon1 παρουσιάζει διπλή υποκυτταρική στόχευση και στους χλωροπλάστες, όμως δεν υπάρχουν ακόμη στοιχεία για το λειτουργικό της ρόλο στο οργανίδιο. Η πρωτεάση Lon4 παρουσιάζει και αυτή διπλή υποκυτταρική στόχευση στα μιτοχόνδρια και στους χλωροπλάστες, όμως δεν υπάρχουν δημοσιευμένα μεταλλάγματα ή άλλα δεδομένα όσον αφορά τη λειτουργία της. Η πρωτεάση Lon3, ελλείψει πειραματικών δεδομένων, θεωρείται ως ψευδογονίδιο, ενώ η Lon2 αποτελεί την περοξυσωμική ισομορφή. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση του λειτουργικού ρόλου της πρωτεάσης Lon του φυτού Arabidopsis thaliana στα μιτοχόνδρια και τους χλωροπλάστες του φυτού. Έγινε κατασκευή διαγονιδιακών κατασκευών με την πρωτεάση Lon1, όπου η αγρίου τύπου πρωτεάση οδηγήθηκε μεμονωμένα στους χλωροπλάστες ή στα μιτοχόνδρια του μεταλλάγματος lon1-1. Οι βιομετρικές, φυσιολογικές και μοριακές αναλύσεις των κατασκευών αυτών ανέδειξαν για πρώτη φορά το λειτουργικό ρόλο της πρωτεάσης Lon1 στο χλωροπλάστη. Επιπλέον, χαρακτηρίστηκε και αναλύθηκε το μετάλλαγμα lon4-1, το οποίο είναι το πρώτο που καταγράφεται για την πρωτεάση Lon4. Τα μεταλλάγματα αυτά παρουσιάζουν σημαντική υστέρηση στη βλαστικότητα των σπερμάτων τους, ενώ και η αναπνευστική δραστηριότητα των σπερμάτων τους είναι μειωμένη. Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης όλων των μιτοχονδριακών/χλωροπλαστικών γονιδίων Lon του φυτού έδειξε ότι το Lon1 δεν παρουσιάζει κάποια ιστοειδική ή χρονική εξειδίκευση, αντίθετα με τα Lon4 και Lon3. Το Lon4 παρουσιάζει μια χρονική εξειδίκευση κατά τα στάδια της γονιμοποίησης και τα αρχικά στάδια της εμβρυογένεσης, ενώ παρουσιάζει και ιστοειδική εξειδίκευση στα ανθικά μέρη του φυτού αποκλειστικά στον ύπερο του άνθους. Το γονίδιο Lon3, για πρώτη φορά αποδεικνύεται ότι δεν αποτελεί ψευδογονίδιο, και παρουσιάζει ιστοειδική έκφραση ως προς τα αρσενικά μέρη του άνθους. Εκτενής φυλογενετική ανάλυση της πρωτεάσης Lon έδειξε ότι τα φυτά, σε αντίθεση με τα ζωικά μοντέλα που φέρουν μόνο ένα αντίγραφο, έχουν πολλαπλά αντίγραφα της μιτοχονδριακής/χλωροπλαστικής πρωτεάσης Lon στο γονιδίωμά τους. Το φαινόμενο σχετίζεται με την βιοχημική πολυπλοκότητα των φυτικών συστημάτων. Οι τρείς ισομορφές του φυτού A. thaliana αποτελούν προϊόντα διαδοχικών διπλασιασμών του γονιδιώματος που εξαιτίας εξελικτικής πίεσης, ανέπτυξαν διαφορετικούς και συμπληρωματικούς μηχανισμούς έκφρασης, στόχευσης και πρωτεόστασης. Οι διπλασιασμοί των μελών της οικογένειας Lon συνέβαλλαν στην βελτίωση της προσαρμοστικότητας και ελαστικότητας έναντι ακραίων περιβαλλοντικών συνθηκών.

Subcellular organelles of eukaryotic cells play a very important role in cell metabolism. In mitochondria, chloroplasts and peroxisomes occur respiration, photosynthesis and fatty acid metabolism, respectively, processes necessary for the survival of organisms. Due to the increased electron flow in the operation of organelles Reactive Oxygen Species (ROS) are produced as byproducts of aerobic metabolism, which are toxic for the cell, adversely affecting cell biomolecules. To address the adverse effects of ROS action, cells have developed defense mechanisms to limit their harmful action. The Protein Quality Control (PQC) system belongs to this mechanism, part of which is the Lon protease, that hydrolyzes the oxidized proteins, thus preventing the formation of toxic protein aggregates in the cell. The Lon protease is of prokaryotic origin and is found in all organisms. Dysfunction of mitochondrial Lon protease disrupts the normal morphology and function of the organelle and in animal models is associated with a variety of neurodegenerative diseases and tumors. In the model plant A. thaliana there is family of 4 genes encoding isoforms of the Lon protease. Mutants of Lon1 gene show abnormal morphology of their mitochondria and reduced respiratory activity. Recent studies have shown that Lon1 posess dual subcellular targeting also into chloroplasts, but there is still no evidence for a functional role in the organelle. Lon4 protease also presents dual subcellular targeting to mitochondria and chloroplasts, but there are no published mutants or other data regarding its function. Due to the absence of experimental data, Lon3 is considered as a pseudogene while Lon2 is the peroxysomal isoform. The aim of this study was to investigate the functional role of Lon protease in mitochondria and chloroplasts of the model plant Arabidopsis thaliana. Transgenic plant lines of Lon1 protease were constructed, where the wild-type protease was driven individually into the chloroplasts or mitochondria of the mutant lon1-1. Biometric, physiological and molecular analyses of these transgenic lines, revealed for the first time a functional role of Lon1 protease in the chloroplasts. Moreover, analysis of the lon4-1 mutant has shown a significant retardation in seed germination, while the respiratory activity of the seeds was also reduced. Gene expression analysis of all the mitochondrial/chloroplastic isoforms of Lon genes of the plant revealed that Lon1 didn’t show any spatiotemporal specificity, while it was ubiquitisly expressed, unlike Lon4 and Lon3, where Lon4 showed a temporal specificity against early stages of embryogenesis and fertilization and a tissue-specific epression in the flower pistil. Lon3 exhibited a tissue specific expression in the stamens of the flower, revealing for the first time that it is not a pseudogene. Extensive phylogenetic analysis of Lon protease showed that plants carry multiple copies of the mitochondrial/chloroplastic isoform of Lon protease in their genome, in contrast to animal models that have only one gene, reflecting the biochemical complexity of plant systems. The three isoforms of A. thaliana have resulted from successive Whole Genome Duplication (WGD) events, which evolved different and complementary mechanisms that contributed to the increase of speciation and genetic richness of species providing adaptive advantage for colonization harsh and fickle ecosystems, maintaining the proteostasis and normal operation of the organelle.