Αξιοποίηση μοριακών μεθόδων στη βελτίωση ανθεκτικότητας των εσπεριδοειδών στο Citrus exocortis viroid, στον έλεγχο της υγείας των εσπεριδοειδών υπό εξυγίανση και στη μελέτη διαφορικής έκφρασης γονιδίων ποικιλιών λεμονιάς

Abstract

Τα εσπεριδοειδή υπόκεινται σε καταπονήσεις από βιοτικούς και αβιοτικούς παράγοντες. Το ιοειδές της εξωκορτίδας των εσπεριδοειδών (CEVd) προκαλεί έντονα συμπτώματα στα δένδρα που είναι εμβολιασμένα στο υποκείμενο Poncirus trifoliata (L.) Raf. και τα υβρίδιά του, που αξιοποιούνται προς αντικατάσταση της νεραντζιάς. Η πλέον αποτελεσματική προσέγγιση για την αντιμετώπιση των καταπονήσεων στα φυτά είναι η χρήση ανθεκτικών ποικιλιών, μέσω κλασικής βελτίωσης ή/και γενετικής μηχανικής. Η εφαρμογή της γενετικής μηχανικής προϋποθέτει την ύπαρξη ενός αποτελεσματικού πρωτοκόλλου ιστοκαλλιέργειας για κάθε γονότυπο. Η παρούσα μελέτη αρχικά επικεντρώθηκε στον προσδιορισμό του καταλληλότερου πρωτόκολλου γενετικού μετασχηματισμού για διαφορετικούς γονότυπους εσπεριδοειδών. Μία από τις πλέον αποτελεσματικές μεθόδους για την επίτευξη ανθεκτικότητας σε ιούς και ιοειδή είναι η αξιοποίηση της RNA σιώπησης (RNA silencing, RNAi). Στόχο της παρούσας μελέτης αποτέλεσε η ανάπτυξη διαγονιδιακής ανθεκτικότητας έναντι του ιοειδούς CEVd στο φυτό-μοντέλο N. benthamiana που δεν αποτελεί ξενιστή του CEVd. Για το σκοπό αυτό, αρχικά επιχειρήθηκε η μόλυνση φυτών N. benthamiana μέσω δύο προσεγγίσεων: α) αγροεμποτισμού και β) γενετικού μετασχηματισμού, με πλασμίδιο που φέρει το διμερές μόριο του CEVd. Τα ευρήματα κατέδειξαν τον αργό ρυθμό πολλαπλασιασμού του CEVd στα αγρο-εμποτισμένα φυτά, σε αντίθεση με τα διαγονιδιακά φυτά που πολλαπλασίαζαν επιτυχώς το ιοειδές. Προκειμένου να διερευνηθεί η ικανότητα τμημάτων του CEVd να επάγουν σιώπηση της έκφρασης του ιοειδούς, πραγματοποιήθηκε μόλυνση τους με δύο τμήματα της αλληλουχίας του CEVd υπό μορφή φουρκέτας. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα τμήματα αυτά μπορούν να προκαλέσουν σιώπηση στο ιοειδές περιορίζοντας το ρυθμό πολλαπλασιασμού του. Προκειμένου να διερευνηθεί εάν ο φαινότυπος ανθεκτικότητας στο φυτό N. benthamiana μπορεί να επιτευχθεί και στα εσπεριδοειδή, επιχειρήθηκε η ενσωμάτωση των δύο τμημάτων του CEVd σε γονότυπους εσπεριδοειδών. Παράλληλο στόχο αποτέλεσε η ανάπτυξη διαγονιδιακής ανθεκτικότητας στην ασθένεια της ψώρωσης των εσπεριδοειδών, μέσω ένθεσης τμήματος της καψιδιακής πρωτεΐνης του ιού της ψώρωσης (CPsV) σε νεραντζιά και «Μαγληνή» λεμονιά. Για την αντιμετώπιση των ασθενειών των εσπεριδοειδών είναι πολύ σημαντική η χρήση υγιούς πολλαπλασιαστικού υλικού. Μια αποτελεσματική μέθοδος παραγωγής εξυγιασμένων φυτών είναι ο in vitro μικροεμβολιασμός κορυφαίων μεριστωμάτων. Από τον έλεγχο που διενεργήθηκε σε φυτά λεμονιάς, πορτοκαλιάς και μανταρινιάς που είχαν παραχθεί με την εφαρμογή της εν λόγω τεχνικής, διαπιστώθηκε η απουσία των σημαντικότερων ιών και ιοειδών, υποδεικνύοντας ότι υπάρχει και στη χώρα μας η απαραίτητη τεχνογνωσία για την εξυγίανση του πολλαπλασιαστικού υλικού των εσπεριδοειδών. Τέλος, πραγματοποιήθηκε η μελέτη ορισμένων αλληλουχιών που υπερεκφράζονται στην ελληνική ποικιλία λεμονιάς «Αδαμοπούλου» σε σύγκριση με την πορτογαλική ποικιλία «Lisbon», η διαφορά των οποίων έγκειται στο ότι η «Αδαμοπούλου» είναι ανεκτική στην κορυφοξήρα και το ψύχος σε αντίθεση με τη «Lisbon». Αρκετές από τις υπό μελέτη αλληλουχίες παρουσίασαν ομολογία με πρωτεΐνες που εμπλέκονται άμεσα ή έμμεσα στους αμυντικούς μηχανισμούς των φυτών έναντι βιοτικών και αβιοτικών καταπονήσεων, ενώ η διαφορά στην έκφραση μεταξύ των δύο ποικιλιών για επτά επιλεγμένα γονίδια κυμαίνεται σε διάφορα επίπεδα.

Citrus are subjected to substantial biotic and abiotic stresses. Citrus exocortis viroid (CEVd) causes severe symptoms in trees grafted on Poncirus trifoliata (L.) Raf. and its hybrids which are employed for the replacement of sour orange. The most effective method of controlling biotic and abiotic stresses in plants refers to the use of resistant varieties, developed through classical breeding and/or genetic engineering. The exploitation of genetic engineering requires the existence of an efficient tissue culture protocol for each citrus species. The present study initially focused on the determination of the most suitable genetic transformation protocol for several citrus genotypes. One of the most efficient methods for the generation of resistance against viruses and viroids refers to the exploitation of RNA silencing (RNAi). Aim of this study was the development of transgenic CEVd resistance in the model plant Nicotiana benthamiana, a non-host of CEVd. The CEVd-inoculation of N. benthamiana plants was pursued by two different approaches: a) agroinfiltration and b) stable genetic transformation, using a plasmid harboring the dimeric CEVd molecule. The results indicate a low rate of CEVd replication in the agroinfiltrated plants, in contrast to transgenic plants which were capable of CEVd replication. Aiming at inducing silencing of the CEVd, transgenic plants replicating the viroid were inoculated with two different self-complementary hairpin RNA fragments from the CEVd genome. The results indicated that both CEVd regions are capable of triggering RNA silencing, thus causing a reduction to the viroid replication rate. To investigate whether the observed resistant phenotype of N. benthamiana plants can be achieved in citrus species, the introgression of two selected segments of the CEVd genome was pursued in various citrus genotypes. Parallel aim was the generation of transgenic resistance against citrus psorosis disease, through the introgression of the viral coat protein of Citrus psorosis virus (CPsV) in sour orange and “Maglini” lemon. The most important method to control citrus diseases is the use of healthy certified propagation material. An effective method for plant sanitation is in vitro micrografting. The study of in vitro micrografted lemon, orange and mandarin plants verified the absence of the most important viruses and viroids, indicating that the necessary expertise for sanitation of the precious citrus propagation material exists in our country. Finally, this dissertation included the study of certain sequences which are overexpressed in the Greek lemon ”Adamopoulou” compared to the Portuguese ”Lisbon”. The difference between the two varieties is that ”Adamopoulou” is tolerant to mal secco and cold compared to “Lisbon”. Several of the sequences under study presented homology with proteins directly or indirectly involved in the defense mechanisms of plants against biotic and abiotic stresses, with the difference between the two varieties in expression of seven genes being at varying levels.