Biofilm formation, stress responses and virulence genes diversity in Listeria monocytogenes

Abstract

Listeria monocytogenes is a versatile bacterium, able to exist as a saprophyte in the environment or as an invasive intracellular pathogen in the host. It is the causative agent of foodborne listeriosis, a severe disease with high impact outbreaks. During its saprophytic life cycle, it forms biofilms on biotic and abiotic surfaces, while once in the host it presents variable levels of pathogenicity. L. monocytogenes is widespread in the environment and may contaminate fresh produce during pre-harvest or post-harvest treatments. Under cold storage, pathogen may encounter hostile conditions, which will possibly affect its physiology. The present thesis was conducted pursuing the following objectives: (i) to examine the adaptive behavior of the pathogen when it contaminates and stored on fresh produce, in terms of its subsequent response to food related stress factors (i.e., acid, osmotic and heat stress) (CHAPTER 2); (ii) to study the correlation between biofilm formation and resistance to biocides, with respect to inter-strain variation and different abiotic surface types (CHAPTER 3); and (iii) to investigate the polymorphism of the prfA-virulence gene cluster (pVGC; pclA, prfA, hly, mpl, actA, and plcB genes) with regards to different serotypes (i.e., 1/2a and 4b) and geographical dispersion (i.e., Australian, Greek and Irish) in isolates of intracellular (clinical) or saprophytic (food-associated environment) origin (CHAPTER 4). Results of Chapter 2 showed that a prior habitat of L. monocytogenes, such as fresh produce stored at low temperatures, might provide pathogen cells with resistance to subsequent antimicrobial treatments raising important food safety implications. The acquired physiological responses will be determined by the product type and the storage period; pathogen cells habituated on tomato were more tolerant (P < 0.05) to acid or osmotic stress than those habituated on lettuce, and habituation on both foods resulted in more stress resistant cells than the control cells, grown in laboratory synthetic medium. On the contrary, the highest resistance to heat stress (P < 0.05) was exhibited by lettuce-habituated L. monocytogenes cells. Prolonged starvation on fresh produce (5 days vs. 24 h) increased resistance to osmotic and acid stress, but reduced thermotolerance, regardless of the pre-exposure environment (i.e., tomatoes or lettuce). In Chapter 3, it was shown that biofilms formed by L. monocytogenes vary significantly among strains and between different surface types. Polystyrene surface was more prone to biofilm development (P = 0.002) and the formed biofilms exhibited higher resistance to biocides compared to those formed on stainless steel (P = 0.0003). Intrinsic tolerance of L. monocytogenes strains to quaternary ammonium compounds (QACs) was correlated to their ability to form biofilms on stainless steel (P = 0.03). Strains differed in their intrinsic or biofilm resistance to biocides (peracetic acid) by up to 24-fold, while a positive correlation between these two parameters was observed (P = 0.02). In Chapter 4, genotyping of the pVGC of 36 L. monocytogenes strains revealed that geographical dispersion might induce adaptation, influencing the polymorphism of virulence genes; serotype 4b Irish strains had distinct hly types from Greek and Australian strains, and Australian strains showed less diversity in plcB and mpl relative to their Irish or Greek counterparts. Diversity between food and clinical isolates was reflected on prfA, actA, and plcB sequences, where the two groups presented different evolutionary pathways. The most conserved genes were prfA and hly and the most diversified was the actA, suggesting possibly new roles for ActA and the necessity for the pathogen to maintain prfA and hly genes. Grouping of the isolates by serotype comprised a distinct and well-defined unit compared to other groupings (i.e., isolation source or geographical origin), with higher within-1/2a serotype divergence compared to 4b serotype. Overall, the findings of the thesis underline the adaptive behavior of L. monocytogenes, which confers to numerous advantages in diverse environments. The acquired features may provide pathogen with increased resistance to food-related stress factors. Virulence genes are also, at least partially, affected by the environment, which possibly contributes to the differentiation in virulence levels among strains and epidemiological dominance of certain subgroups over others.

Ο μικροοργανισμός Listeria monocytogenes είναι ένα ιδιαίτερα πολύπλευρο βακτήριο, ικανό να ενυπάρχει ως σαπρόφυτο στο περιβάλλον και ως ενδοκυττάριο παθογόνο μέσα σε ξενιστή. Αποτελεί αιτία της τροφιμογενούς λοίμωξης «λιστερίαση», που είναι μια σοβαρή ασθένεια με υψηλής σημασίας επιπτώσεις στην υγεία, αλλά και στην οικονομία. Κατά τη διάρκεια της σαπροφυτικής του μορφής ζωής, αποικεί σε βιοτικές και αβιοτικές επιφάνειες, σχηματίζοντας βιοϋμένια, ενώ ως παθογόνο μέσα σε ξενιστή, επιδεικνύει διάφορα επίπεδα λοιμωξιογόνου δράσης. Η ευρεία διάδοση του παθογόνου στο περιβάλλον, το καθιστά ικανό να επιμολύνει φρέσκα φυτικά προϊόντα σε οποιαδήποτε φάση της καλλιέργειας, συγκομιδής ή επεξεργασίας τους. Κατά τη φύλαξη των φυτικών προϊόντων σε χαμηλές θερμοκρασίες, το παθογόνο αντιμετωπίζει αντίξοες συνθήκες που πιθανόν να επηρεάσουν τη φυσιολογία του. Η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε με τους εξης στόχους: (α’) την εξέταση της προσαρμοστικής συμπεριφοράς του παθογόνου σε φρέσκα φυτικά προϊόντα, όπως αυτή εκφράζεται κατά την μετέπειτα απόκριση του παθογόνου σε συνθήκες καταπόνησης που σχετίζονται με την επεξεργασία τροφίμων (ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2), (β’) τη διερεύνηση της συσχέτισης μεταξύ σχηματισμού βιοϋμενίων και απόκρισης σε αντιμικροβιακές ουσίες, όπως αυτή παραλάσσει μεταξύ διαφορετικών στελεχών και αβιοτικών επιφανειών (ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3), και (γ’) τη μελέτη της διαστελεχιακής παραλλακτικότητας στο σύμπλεγμα γονιδίων παθογένειας prfA, όπως αυτή διαμορφώνεται μεταξύ στελεχών διαφορετικών οροτύπων (1/2a και 4b), διαφορετικής γεωγραφικής προέλευσης, (Αυστραλία, Ελλάδα, Ιρλανδία), και διαφορετικής πηγής απομόνωσης (τρόφιμα ή κλινικές περιπτώσεις) (ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4). Τα αποτελέσματα του Κεφαλαίου 2 έδειξαν ότι, το ενδιαίτημα στο οποίο προϋπήρξε το παθογόνο, όπως είναι το φρέσκο φυτικό προϊόν σε χαμηλές θερμοκρασίες φύλαξης, μπορεί να προστατεύσει τα κύτταρα κατά τη μετέπειτα υποβολή τους σε αντιμικροβιακούς χειρισμούς, αυξάνοντας με αυτόν τον τρόπο τον κίνδυνο για την ασφάλεια των τροφίμων. Οι μεταβολές αυτές είναι σε άμεση συσχέτιση με το είδος του φυτικού προϊόντος και τη διάρκεια προσαρμογής τους σε αυτό. Στα κύτταρα που επωάστηκαν πάνω σε τοματίνια, ενισχύθηκε η ικανότητά τους να ανθίστανται σε παρεμποδιστικά επίπεδα ωσμωτικής ή όξινης καταπόνησης, σε σχέση με αυτά που επωάστηκαν επάνω σε επιφάνειες μαρουλιού (P < 0.05). Αντίθετα, υψηλότερη θερμοανθεκτικότητα κυττάρων παρατηρήθηκε μετά την επώασή τους πάνω σε μαρούλι. Η παρατεταμένη επώση σε χαμηλές θερμοκρασίες (δηλ., 5 ημέρες έναντι 24 ωρών), ενίσχυσε την ανθεκτικότητα σε όξινη και ωσμωτική καταπόνηση, σε αντίθεση με το θερμική καταπόνηση, στην οποία τα κύτταρα παρουσίασαν μεγαλύτερη ευαισθητοποίηση. Τα αποτελέσματα του Κεφαλαίου 3 έδειξαν ότι, διαφορετικά στελέχη του παθογόνου παράγουν στατιστικώς σημαντικά διαφορετικά επίπεδα βιοϋμενίων, τα οποία βρίσκονται σε άμεση συσχέτιση με το είδος της αβιοτικής επιφάνειας που αποικούν. Επιφάνειες πολυστυρενίου ήταν πιο επιρρεπείς σε αυτή την εποίκιση από κύτταρα του παθογόνου (P = 0.002) σε σχέση με τον ανοξείδωτο χάλυβα. Τα σχηματισθέντα βιοϋμένια επέδειξαν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα σε βακτηριοκτόνες ουσίες από τα αντίστοιχα του ανοιξείδωτου χάλυβα (P = 0.0003). Η ενδογενής ανεκτικότητα των στελεχών L. monocytogenes σε ουσίες τεταρτοταγούς αμμωνιίου (QACs), ήταν ανάλογη της ικανότητάς τους να αποικούν σε επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα (P = 0.03). Η ενδογενής ανεκτικότητα των κυττάρων και η ανθεκτικότητα των βιοϋμενίων σε διάλυμα υπεροξικού οξέος, διέφεραν μεταξύ των στελεχών έως και κατά 24 φορές, και η συσχέτιση μεταξύ αυτών των παραμέτρων ήταν θετική (P = 0.02). Στο Κεφάλαιο 4, η γονοτύπηση του pVGC σε 36 στελέχη L. monocytogenes έδειξε ότι, η γεωγραφική διασπορά των στελεχών μπορεί να επάγει προσαρμοστικούς μηχανισμούς που θα επιδράσουν στον πολυμορφισμό των γονιδίων, απαραίτητων για την λοιμωξιογόνο δράση του βακτηρίου. Στελέχη απομονωμένα στην Ιρλανδία με ορότυπο 4b είχαν διαφορετικούς τύπους γονιδίου hly από στελέχη απομονωμένα στην Αυστραλία ή την Ελλάδα. Επιπλέον, στελέχη από την Αυστραλία είχαν μικρότερη ποικιλομορφία σε σχέση με τα στελέχη Ελλάδας και Ιρλανδίας στα γονίδιο plcB και mpl. Σχετικά με την πηγή απομόνωσης, η διαφορετικότητα μεταξύ στελεχών προερχόμενων από περιβάλλοντα τροφίμων και από κλινικές περιπτώσεις ήταν εμφανής στα γονίδια prfA, actA και plcB, με τις δυο ομάδες στελεχών να δείχνουν διαφορετικά μονοπάτια εξέλιξης. Τα πιο συντηρημένα γονίδια του συμπλέγματος ήταν το prfA και το hly, ενώ το πιο ποικιλόμορφο ήταν το actA, υποδεικνύοντας πιθανόν νέους ρόλους για το ActA και την αναγκαιότητα συντήρησης των prfA και hly. Η ομαδοποίηση κατά ορότυπο, αποτέλεσε μια καλά δομημένη ομάδα σε σχέση με τις άλλες, (δηλ. με βάση τη γεωγραφική προέλευση ή την πηγή απομόνωσης), με μεγαλύτερη ποικιλομορφία σε στελέχη ορότυπου 1/2a από ό,τι στον ορότυπο 4b. Συνολικά, τα αποτελέσματα της διατριβής είναι ενδεικτικά της προσαρμοστικής φύσης του L. monocytogenes, η οποία του παρέχει έναν αξιόλογο αριθμό πλεονεκτημάτων επιβίωσης σε διάφορα περιβάλλοντα και διαμορφώνει την εξελικτική του πορεία. Τα γονίδια μολυσματικότητας φαίνεται να διαμορφώνονται με βάση το περιβάλλον διαβίωσης, με συνέπεια τη διαφοροποίηση μεταξύ στελεχών στα επίπεδα λοιμωξιογόνου δράσης τους, και την επιδημιολογική κυριαρχία συγκεκριμένων ομάδων στελεχών έναντι άλλων.