Ακολουθώντας την προσέγγιση της Πρόσθιας Γενετικής μέσω τυχαίας μεταλλαξογένεσης με αιθυλνιτροζουρία (N-ethyl-N-nitrosourea, ENU), η ερευνητική ομάδα της Δρ. Ελένης Ντούνη ταυτοποίησε ένα νέο μοντέλο αυτοσωμικής υπολειπόμενης νευρολογικής νόσου στο ποντίκι. Τα συμπτώματα εμφανίζονται με πλήρη διεισδυτικότητα εξίσου στα δύο φύλα την τρίτη εβδομάδα από την γέννηση και χαρακτηρίζονται από αταξία, αστάθεια στην κίνηση, κρίσεις επιληψίας, απώλεια αντανακλαστικού έκτασης των οπίσθιων άκρων, μειωμένο σωματικό βάρος και μυϊκή δύναμη και πρόωρη θνησιμότητα. Λόγω των κλινικών συμπτωμάτων, το νέο αυτό μοντέλο ονομάστηκε αταξικό. Εφαρμόζοντας γενετική ανάλυση σύνδεσης εντοπίστηκε μια μη νοηματική σημειακή μετάλλαξη (C σε T) στην κωδική περιοχή του γονιδίου Slc25a46, μέλους της οικογένειας των μιτοχονδριακών μεταφορέων SLC25 (Solute Carrier Family 25, SLC25). Η μετάλλαξη αυτή εισάγει ένα πρόωρο κωδικόνιo λήξης κωδικοποιώντας ένα πολυπεπτίδιο 95 αμινοξέων αντί της άγριου τύπου πρωτεΐνης που αποτελείται από 418 αμινοξέα. Η SLC25A46 πρωτεΐνη του ανθρώπου εντοπίζεται στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη και τελευταία δεδομένα προτείνουν τη συμμετοχή της σε διαδικασίες της μιτοχονδριακής δυναμικής και της διατήρησης της δομής των αναδιπλώσεων της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης. Πρόσφατα, ανιχνεύτηκαν μεταλλάξεις στο ανθρώπινο SLC25A46 γονίδιο σε ένα ευρύ φάσμα νευρολογικών ασθενειών που συμπεριλαμβάνουν οπτική ατροφία, τη νόσο Charcot-Marie-Tooth τύπου 2, το σύνδρομο Leigh, την προοδευτική μυοκλονική αταξία και τη θνησιγόνο συγγενή γεφυροπαρεγκεφαλιδική υποπλασία.
Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν ο φαινοτυπικός χαρακτηρισμός του αταξικού μοντέλου και η συσχέτιση με την παθολογία στον άνθρωπο, η γενετική επιβεβαίωση της υπεύθυνης μετάλλαξης στο Slc25a46 γονίδιο και η μελέτη του προτύπου έκφρασης του άγριου τύπου και του μεταλλαγμένου Slc25a46 γονιδίου για την κατανόηση της παθοφυσιολογίας στις SLC25A46-επαγόμενες ασθένειες. Τα αποτελέσματα της φαινοτυπικής και ιστοπαθολογικής ανάλυσης έδειξαν ότι τα αταξικά ποντίκια εμφανίζουν τα κύρια χαρακτηριστικά που εκδηλώνονται στους αντίστοιχους ασθενείς, όπως αλλοιώσεις στην παρεγκεφαλίδα και στους νευράξονες των γαγγλιακών κυττάρων του αμφιβληστροειδούς, ενδεικτικό της οπτικής ατροφίας. Επίσης, τα αταξικά ποντίκια εμφανίζουν ένα διακριτό φαινότυπο στο ανοσοποιητικό σύστημα που εκδηλώνεται με υποπλασία σε θύμο και σπλήνα. Η απουσία των ώριμων λεμφοκυττάρων δεν αναστρέφει τα νευρολογικά συμπτώματα, δείχνοντας ότι το ανοσοποιητικό σύστημα δεν ευθύνεται για το νευρολογικό φαινότυπο. Επιπλέον, για να επιβεβαιωθεί γενετικά ότι η μετάλλαξη στο γονίδιο Slc25a46 είναι υπεύθυνη για τον αταξικό φαινότυπο, δημιουργήσαμε διαγονιδιακά ποντίκια που φέρουν το ανθρώπινο hSLC25A46 γονίδιο. Διασταύρωση των διαγονιδιακών αυτών ποντικών με τα αταξικά ποντίκια έδειξε ότι ο αταξικός φαινότυπος αναστρέφεται πλήρως παρουσία του ανθρώπινου διαγονιδίου, επιβεβαιώνοντας ότι η μετάλλαξη στο Slc25a46 γονίδιο είναι υπεύθυνη για το φαινότυπο.
Η μελέτη του προτύπου έκφρασης του Slc25a46 γονιδίου τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης έδειξε υψηλή έκφραση στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) ποντικών άγριου τύπου. Όσον αφορά στη μετάλλαξη δε φαίνεται να επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου αλλά την παραγωγή της πρωτεΐνης μιας και η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη απουσιάζει από τα αταξικά ποντίκια. Mε ανοσοαποτύπωμα Western σε κλάσματα ιστών του ΚΝΣ και με υπερέκφραση της άγριου τύπου SLC25A46-ΕGFP πρωτεΐνης στην κυτταρική σειρά Ν2Α, διαπιστώσαμε ότι η SLC25A46 πρωτεΐνη του ποντικού επίσης εντοπίζεται στο μιτοχονδριακό κλάσμα. Επιπλέον, υπερεκφράζοντας τη μεταλλαγμένη SLC25A46-ΕGFP πρωτεΐνη, παρατηρήσαμε ότι το πεπτίδιο των 95 αμινοξέων δεν μπορεί να ενσωματωθεί στη μιτοχονδριακή μεμβράνη. Περαιτέρω πειράματα, φανέρωσαν ότι η SLC25A46 πρωτεΐνη του ποντικού είναι μια μιτοχονδριακή πρωτεΐνη της εξωτερικής μεμβράνης, όπως και η ανθρώπινη ομόλογή της.
Καθώς η SLC25A46 πρωτεΐνη εντοπίζεται στο μιτοχόνδριο, προχωρήσαμε στη μελέτη της μιτοχονδριακής λειτουργίας στο αταξικό μοντέλο για να ελέγξουμε αν η απουσία της SLC25A46 πρωτεΐνης επηρεάζει βασικές λειτουργίες του μιτοχονδρίου. Για το σκοπό αυτό, εφαρμόσαμε διάφορες μιτοχονδριακές δοκιμές σε πρωτογενείς καλλιέργειες ποντικών άγριου τύπου και αταξικών καθώς και σε ένα κυτταρικό μοντέλο επαγόμενης αποσιώπησης της ανθρώπινης SLC25A46 πρωτεΐνης που δημιουργήθηκε στα πλαίσια της παρούσας διατριβής. Συγκεντρωτικά, η απουσία της SLC25A46 πρωτεΐνης δεν φάνηκε να επιφέρει δραματικές αλλαγές στη μιτοχοδριακή λειτουργία, όπως και στους αντίστοιχους ασθενείς. Πρωτεομική ανάλυση σε μιτοχονδριακά εμπλουτισμένα δείγματα από εγκέφαλο, παρεγκεφαλίδα και ήπαρ ποντικών άγριου τύπου και αταξικών, φανέρωσε ότι ειδικά στην παρεγκεφαλίδα των αταξικών ποντικών η απουσία της SLC25A46 πρωτεΐνης επηρεάζει σημαντικά τα επίπεδα των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην μιτοχονδριακή δυναμική και τη διατήρηση των αναδιπλώσεων της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης και πιθανώς αυτό να συσχετίζεται με τους παθογενετικούς μηχανισμούς.
Το αταξικό μοντέλο που μελετήθηκε στην παρούσα διατριβή αποτελεί το πρώτο ζωικό μοντέλο που φέρει μετάλλαξη στο Slc25a46 γονίδιο. Δεδομένου ότι η SLC25A46 πρωτεΐνη του ποντικού και του ανθρώπου παρουσιάζουν μεγάλη συντήρηση, σε συνδυασμό με την πλήρη αναστροφή του φαινοτύπου από το ανθρώπινο διαγονίδιο και την καταγραφή SLC25A46 μεταλλάξεων σε ασθενείς, καθιστούν το αταξικό μοντέλο ιδανικό για την κατανόηση των εμπλεκόμενων παθογενετικών μηχανισμών και την εφαρμογή νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων.
Following a forward genetics approach through random mutagenesis with N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), Dr. Douni's research group identified a novel mouse model of severe autosomal recessive neurological disease. The symptoms start at 3 weeks of age with full penetrance in both sexes and are characterized by ataxia, unsteady locomotion, episodic crises, failure of limb clasping, reduced body weight and muscle strength and early lethality. Due to the prominent neurological symptoms, the novel mouse model was designated as ataxic. Using genome-wide linkage analysis a nonsense point mutation (C to T) was identified in the coding region of the Slc25a46 gene, a member of the mitochondrial carrier family SLC25 (Solute Carrier Family 25), which introduces a premature stop codon encoding a 95 amino acid polypeptide instead of 418 amino acids. Human SLC25A46 is an outer membrane protein and recent findings suggest a role in mitochondrial dynamics and cristae maintenance. Mutations in the SLC25A46 gene have been recently identified in a wide spectrum of neurological diseases, including inherited optic atrophy, Charcot-Marie-Tooth type 2, Leigh syndrome, progressive myoclonic ataxia and lethal congenital pontocerebellar hypoplasia.
The objectives of this study was the phenotypic characterization of the mutant mice and its correlation with the human pathology, the genetic confirmation of the causal mutation and the expression analysis of wild-type and mutant Slc25a46 gene in order to understand the pathophysiology of SLC25A46-induced diseases. The results of our histopathological analysis showed that mutant mice manifest the main clinical features identified in patients, such as cerebellar lesions and underdeveloped retinal ganglion cell dendrites, indicative of optic atrophy. Moreover, ataxic mice manifest a distinct immunological phenotype which is characterized by thymic and splenic hypoplasia. The absence of mature lymphocytes did not reverse the neurological symptoms, indicating that the immune system is not responsible for the ataxic phenotype. Furthermore, to genetically confirm the causality of the identified mutation in the Slc25a46 gene, we generated transgenic mice that carry the human hSLC25A46 transgene. The ataxic phenotype was completely reversed in the presence of the human transgene, confirming that the mutation in the Slc25a46 gene is responsible for the ataxic phenotype.
The expression analysis of Slc25a46 both at mRNA and protein level showed a specific expression in the central nervous system (CNS) of wild-type mice. As regards the mutation, it does not seem to affect the mRNA but the protein levels as the mutant protein is undetectable in ataxic mice. Through western blot analysis in mitochondrial enriched samples and overexpression of the SLC25A46-EGFP protein in the N2A cell line, we confirmed the mitochondrial localization of wild-type mouse SLC25A46 protein. Overexpressing the mutant SLC25A46-EGFP protein in the same cell line, we observed that the 95 amino acid peptide can not be incorporated into the mitochondrial membrane. Further experiments revealed that the SLC25A46 mouse protein is a mitochondrial outer membrane protein, similar to the human homolog.
As SLC25A46 protein localizes to mitochondria, we investigated whether its absence affects mitochondrial function. For this purpose, we applied several mitochondrial assays in primary cultures of wild-type and ataxic mice and in an induced knockdown system generated in the present study. Collectively, our results showed that the absence of the SLC25A46 protein did not affect dramatically the main mitochondrial parameters. These results are consistent with the corresponding studies in human patients. Proteomic analysis in mitochondrial enriched samples of brain, cerebellum and liver from wild-type and ataxic mice, revealed that ablation of SLC25A46 protein in the cerebellum of ataxic mice affected remarkably the levels of proteins involved in mitochondrial dynamics and cristae maintenance, which is probably related to pathogenetic mechanisms.
The ataxic model studied in the present thesis is the first mouse model carrying a Slc25a46 mutation. The fact that mouse and human SLC25A46 proteins are highly conserved, along with the complete reversal of the phenotype by the human transgene and the identification of SLC25A46 mutations in patients, renders the ataxic model ideal for understanding the involved pathogenetic mechanisms as well as for the application of novel therapeutic approaches.
