Μοριακός χαρακτηρισμός στελεχών του παθογόνου μικροοργανισμού Listeria monocytogenes απομονωθέντων από φυτικά προϊόντα

Abstract

Ο μικροοργανισμός Listeria monocytogenes έχει αναδειχθεί ως ένα από τα σημαντικότερα τροφιμογενή παθογόνα παγκοσμίως. Αποτελεί αιτία της τροφιμογενούς λοίμωξης «λιστερίωσης» και παρόλο που η ασθένεια έχει χαμηλή συχνότητα εμφάνισης, χαρακτηρίζεται από υψηλά ποσοστά νοσηλείας και θνητότητας (20-30%). Ο σαπροφυτικός αυτός μικροοργανισμός είναι ευρέως διαδεδομένος στο περιβάλλον, με αποτέλεσμα να καθίσταται ικανός να επιμολύνει μία μεγάλη ποικιλία τροφίμων σε διάφορα στάδια της παραγωγικής τους διαδικασίας. Επιπλέον, παρουσιάζει μία αξιοσημείωτη ικανότητα να αντέχει σε μία ευρεία ποικιλία αντίξοων συνθηκών, γεγονός που του επιτρέπει να επιβιώνει και να πολλαπλασιάζεται τόσο σε υποστρώματα που θεωρούνται κατάλληλα για την ανθρώπινη διατροφή, όσο και στον ανθρώπινο γαστρεντερικό σωλήνα. Ως εκ τούτου, ο συγκεκριμένος παθογόνος μικροοργανισμός βρίσκεται στο επίκεντρο εντατικής μελέτης. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε απομόνωση της Listeria monocytogenes από φυτικά προϊόντα, με στόχο (i) τη μελέτη της συμπεριφοράς του παθογόνου μικροοργανισμού έπειτα από έκθεσή του σε διάφορες συνθήκες και υποστρώματα αύξησης, καθώς και (ii) τον μοριακό χαρακτηρισμό των απομονωθέντων στελεχών. Στο κεφάλαιο 3 πραγματοποιήθηκε μελέτη του επιπολασμού και ποσοτική εκτίμηση του πληθυσμού της L. monocytogenes σε δείγματα ρόκας και αγγουριών, καθώς και προσδιορισμός των χαρακτηριστικών επίδοσης των χρωμογόνων θρεπτικών υποστρωμάτων ALOA και Rapid’L.mono, που χρησιμοποιούνται για την ανάκτηση του παθογόνου. Για τη διεκπεραίωση των παραπάνω χρησιμοποιήθηκε αιτιοκρατική και στοχαστική προσέγγιση, καθώς και χρήση παράλληλου ελέγχου και Μπαγεσιανής ανάλυσης. Τέλος, μελετήθηκε η βιοποικιλότητα των στελεχών του παθογόνου μέσω τεχνικών PCR. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη συγκεκριμένη μελέτη κατέδειξαν την ατελή φύση των υποστρωμάτων ανίχνευσης ALOA και RAPID’L.mono, καθώς και τη διαφοροποίηση των χαρακτηριστικών επίδοσης των υποστρωμάτων ανάλογα με το υπό μελέτη προϊόν και ανάλογα με το υπόστρωμα που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του τροφιμογενούς παθογόνου στο προϊόν αυτό. Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε η ανάγκη παράλληλου ελέγχου πολλαπλών δοκιμών με χρήση τουλάχιστον δύο θρεπτικών υποστρωμάτων για την ορθή εκτίμηση της παρουσίας ενός μικροοργανισμού. Τέλος, όσον αφορά στη μελέτη βιοποικιλότητας, κρίθηκε απαραίτητη η χρήση τουλάχιστον τριών μορίων εκκινητών σε περίπτωση εφαρμογής RAPD-PCR ή ο συνδυασμός rep-PCR και RAPD-PCR, για τη μέγιστη διαφοροποίηση των στελεχών. Στο κεφάλαιο 4 αξιολογήθηκε η έκφραση δέκα γονιδίων που σχετίζονται με την παθογονικότητα του μικροοργανισμού L. monocytogenes, κατά τη διάρκεια της ανάπτυξής του παθογόνου σε υγρό θρεπτικό μέσο, ρόκα και πεπόνι τα οποία διατηρήθηκαν στους 4, 10 και 30 οC. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι αύξηση της θερμοκρασίας οδήγησε σε ρύθμιση της έκφρασης όλων των υπό μελέτη γονιδίων και ότι η ρύθμιση αυτή ήταν εξαρτώμενη σε όλες τις περιπτώσεις από τον τύπο του υποστρώματος ανάπτυξης. Παρ’ όλ’ αυτά, δεν προσδιορίστηκε καμία συγκεκριμένη τάση σχετικά με την επίδραση του χρόνου επώασης, της θερμοκρασίας επώασης και του τύπου υποστρώματος ανάπτυξης στη γονιδιακή έκφραση. Ενδιαφέρον ωστόσο προκάλεσε το γεγονός ότι η μελέτη κατέδειξε ότι ο συνολικός χρόνος προετοιμασίας μέχρι τη σταθεροποίηση του RNA από το RNAlater, αποτελεί χρονικό διάστημα το οποίο φαίνεται να είναι αρκετό για τη μεταγραφή των γονιδίων που μελετήθηκαν. Στο κεφάλαιο 5 εξετάστηκε η επίδραση των ατμών αιθέριου ελαίου από λεμονόχορτο στην ανάπτυξη της επιφανειακής μικροχλωρίδας και της L. monocytogenes, σε δείγματα ρόκας και πεπονιού, έπειτα από συσκευασία σε συνθήκες αέρα και σε μικροδιάτρητη δραστική τροποποιημένη ατμόσφαιρα και συντήρηση σε θερμοκρασία 0, 5, 10 και 15 °C. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο συνθήκες συσκευασίας παρουσίασαν συγκρίσιμη διάρκεια εμπορίας των προϊόντων σε όλες τις υπό μελέτη θερμοκρασίες. Ωστόσο, η αρχική μεταβολή στην ατμόσφαιρα επηρέασε σημαντικά την κυρίαρχη μικροχλωρίδα επιφάνειας, καθώς και την επίδραση του αιθέριου ελαίου του λεμονόχορτου στους υπό μελέτη μικροοργανισμούς. Επιπλέον, η αντιμικροβιακή δράση του ελαίου φάνηκε να επηρεάζεται από τις συνολικές συνθήκες συντήρησης, καθώς και από το υπόστρωμα ανάπτυξης. Στο κεφάλαιο 6 πραγματοποιήθηκε περιγραφική και φυλογενετική ανάλυση, καθώς και ανάλυση ανασυνδυασμού και γενετικής επιλογής του συμπλέγματος γονιδίων Listeria Pathogenicity Island 1 (LIPI-1), σε στελέχη της L. monocytogenes τα οποία είχαν διαφορετική προέλευση και ανήκαν στους ορότυπους 1/2a και 4b. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν σημαντική ποικιλομορφία σε όλο το γονιδιακό σύμπλεγμα, ενώ διαφορές παρατηρήθηκαν σε όλα τα γονίδια και τις διαγονιδιακές περιοχές μεταξύ των 1/2a και 4b στελεχών. Επιπλέον, παρατηρήθηκε διαφοροποίηση μεταξύ των ορότυπων, αλλά και διαφοροποίηση μεταξύ των στελεχών 4b ανάλογα με την πηγή απομόνωσης. Τέλος, η ανάλυση γενετικής επιλογής έναντι της ανάλυσης ανασυνδυασμού φάνηκε να κατέχει σημαντικό ρόλο στη μελέτη της εξέλιξης αυτού του γονιδιωματικού συμπλέγματος, αλλά μόνο στην περίπτωση του γονιδίου prfA των απομονώσεων 1/2a και του γονιδίου actA των απομονώσεων 4b από κρέας, για τα οποία υποδείχθηκε αμιγής επιλογή ή επέκταση του πληθυσμού. Στο κεφάλαιο 7 πραγματοποιήθηκε μελέτη της πληθυσμιακής μεταβολής καθώς και έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με την παθογονικότητα του μικροοργανισμού L. monocytogenes, έπειτα από in vitro έκθεσή του σε ανθρώπινο γαστρικό και δωδεκαδακτυλικό υγρό. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι ο παθογόνος κατάφερε να επιβιώσει, παρόλο που σημειώθηκε μείωση του αρχικού του πληθυσμού. Η μείωση αυτή παρατηρήθηκε κατά κύριο λόγο έπειτα από την έκθεση του παθογόνου στο γαστρικό υγρό, ενώ αντιθέτως η έκθεσή του στο δωδεκαδακτυλικό υγρό δεν φάνηκε να έχει αντίκτυπο στα πληθυσμιακά του επίπεδα. Επιπλέον, η μελέτη της γονιδιακής έκφρασης κατέδειξε μικτή απόκριση των εξεταζόμενων γονιδίων, με μεγαλύτερη τάση υπερέκφρασης απ’ ότι υποέκφρασης. Παράλληλα, τα αποτελέσματα της μελέτης κατέδειξαν σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των ιντερναλινών, καθώς και μεταξύ αυτών και του γονιδίου plcB, ενώ σημαντική φάνηκε η συσχέτιση μεταξύ της άυξησης των τιμών του pH και της πιθανότητας υπερέκφρασης των γονιδίων hly και plcA. Τέλος, η υπερέκφραση των υπό μελέτη γονιδίων δεν φάνηκε να σχετίζεται με παράγοντες που δυνητικά επηρεάζουν το γαστρικό και δωδεκαδακτυλικό περιβάλλον, όπως η λήψη αναστολέων αντλίας πρωτονίων και η γαστρική ατροφία. Συνολικά, στη συγκεκριμένη έρευνα πραγματοποιήθηκε απομόνωση της L. monocytogenes από φρέσκα προϊόντα και εκτίμηση των πληθυσμιακών μεταβολών και της γονιδιακής απόκρισής της, έπειτα από έκθεση του μικροοργανισμού σε διάφορες συνθήκες ανάπτυξης. Στόχο αποτέλεσε η μελέτη της συμπεριφοράς του παθογόνου μικροοργανισμού από τη την στιγμή της απομόνωσής του από τα έτοιμα προς κατανάλωση προϊόντα έως και την παραμονή του σε γαστρικά και δωδεκαδακτυλικά υγρά ανθρώπων. Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στην έκφραση των γονιδίων, ακόμα και στις ίδιες μελέτες, κατέδειξαν την ύπαρξη σημαντικής αλληλεπίδρασης μεταξύ της συμπεριφοράς των μικροοργανισμών και του περιβάλλοντος στο οποίο αναπτύσσονται. Επιπλέον, φάνηκε η ύπαρξη επιπρόσθετων ρυθμιστικών μηχανισμών, οι οποίοι μελλοντικά θα μπορούσαν ενδεχομένως σε συνδυασμό με αυτούς που μελετήθηκαν να παρέχουν σημαντικές πληροφορίες για την κατανόηση του τρόπου συμπεριφοράς του μικροοργανισμού στα διάφορα περιβάλλοντα.

Listeria monocytogenes has emerged as one of the major foodborne pathogens worldwide. It is the causative agent of the foodborne disease “listeriosis” and although it has an overall low incidence, it is characterized by high hospitalization and fatality rates (20-30%). This saprophytic microorganism has a ubiquitous distribution in the environment and therefore it is able to contaminate a wide variety of foodstuff in different stages of food processing. In addition, Listeria monocytogenes has the remarkable ability to withstand a wide variety of stresses. Τhis ability enables it to survive and proliferate both on substrates that are considered for human nutrition as well as in the human gastrointestinal tract. Hence, this pathogenic microorganism has been in the epicenter of intensive study. In the present thesis isolation of Listeria monocytogenes from plant products was conducted, in order to (i) study the pathogen behavior after its exposure to various conditions and growth substrates, and (ii) to assess the molecular characterization of the pathogenic isolates. In chapter 3, the prevalence and levels of Listeria monocytogenes in rocket and cucumber samples was determined. In addition, the performance indices of the chromogenic media used for the recovery of the pathogen, ALOA and Rapid’ L.mono were evaluated . Calculation of the above parameters was assessed though deterministic and stochastic approaches, parallel testing and Bayesian inference. Finally, biodiversity of L. monocytogenes isolates was assessed through PCR. The results obtained in this study revealed the imperfect nature of the substrates ALOA and RAPID’L.mono, as well as the diversification of the substrates’ performance indices, depending on the food matrix and the substrate used to detect the foodborne pathogen in question. Moreover, the necessity of using parallel testing with at least two substrates was confirmed. Finally, regarding the biodiversity assay, results showed that at least three primers should be used when RAPD-PCR is being performed and that rep-PCR should be combined with RAPD-PCR for the optimum discrimination of the isolates. In chapter 4, the expression of key virulence genes during growth of L. monocytogenes in liquid medium and on rocket and melon surface stored at 4, 10 and 30 oC was assessed. The results of this study showed that increase of the incubation temperature resulted in the regulation of the expression of all genes under study and that this regulation was in all cases dependent upon the type of substrate. Nevertheless, no particular trend could be identified regarding the effect of incubation temperature, time or type of substrate on gene expression. It is however noteworthy that the study indicated that total preparation time until stabilization of RNA seemed to be enough for the transcription of the genes under study. In chapter 5, the effect of lemongrass oil vapors on surface microbiota and L. monocytogenes growth on rocket salad and melon, packaged in air and microperforated active modified atmosphere (MAMA) conditions and stored at 0, 5, 10, and 15 °C was examined. The results indicated that both packaging conditions resulted in comparable shelf life of the products at all temperatures assessed. However, the initial displacement in the atmosphere affected significantly the dominating surface microbiota as well as the effect of the lemongrass essential oil on the microorganisms under study. In addition, the antimicrobial activity of the essential oil seemed to be affected by the storage conditions and the food matrix. In chapter 6 descriptive, phylogenetic, recombination and selection analyses on alignments of the Listeria Pathogenicity Island 1 (LIPI-1) of 1/2a and 4b L. monocytogenes isolates of different origin were applied. The results indicated a significant diversity throughout the whole genomic island, while differences between 1/2a and 4b strains were observed in all genes and intergenic regions. In addition, discrimination between serotypes was observed and, furthermore, 4b isolates were also differentiated according to their source of isolation as well. Finally, selection, rather than recombination, seemed to play a role in the evolution of this genomic island but only in the case of prfA gene of 1/2a isolates and actA gene of 4b meat isolates for which purifying selection or population expansion was indicated. In chapter 7 examination of L. monocytogenes population changes and assessement of the expression of its virulence-associated genes, after in vitro exposure to human gastric and duodenal aspirate took place. Results indicated that pathogen survived in these conditions, although the initial population was decreased. This decrease was mainly observed after pathogen’s exposure to gastric aspirate, whereas exposure to duodenal aspirate seemed to have no impact on its population levels. Moreover, gene expression assay indicated mixed response of the examined genes, with a greater tendency towards overexpression rather than underexpression. Furthermore, results showed significant correlation between internalins and between internalins and plcB regulation, while significant correlation was indicated between the increase of pH levels and the odds of hly and plcA overexpression. Finally, genes’ overexpression did not seem to be correlated with factors that potentially affect the gastric and duodenal environment, such as PPIs intake and gastric atrophy. In this research isolation of Listeria monocytogenes from fresh produce was performed and population changes and key virulence associated genes expression were assessed after pathogen’s exposure to various conditions. Aim of the study was to determine pathogen’s behavior from fresh produce isolation to residence time in human gastric and duodenal aspirates. The results indicated significant interaction between microorganisms’ response and growth conditions. Moreover, results indicated significant differences in gene expression, suggesting additional regulatory mechanisms which in combination with the studied mechanisms could possibly provide important information for pathogen’s behavior in different environments.