Valorisation of industrial waste and by-product streams for the extraction of phenolic compounds and the development of bioprocesses for the production and purification of succinic acid

Abstract

The scope of this thesis is the evaluation of by-product streams derived from two different industrial sectors as fermentation substrates for succinic acid production as well as the extraction of phenolic compounds and other value-added products. The effective fractionation of these by-product streams could result in the development of advanced biorefinery concepts. Spent sulphite liquor (SSL), is the by-product stream of the acidic sulphite pulping process of Eucalyptus globulus wood in the pulp and paper industry. SSL contains fermentable sugars derived from hemicellulose degradation (with xylose being the predominant one), lignosulphonates, phenolic compounds, acetic acid and other compounds with potential inhibitory effect towards fermenting microorganisms. At the beginning of this study, the effective removal of the phenolic compounds present in SSL was evaluated by employing solvent extraction with ethyl acetate as extracting solvent. The main parameters affecting the extraction of phenolic compounds such as the initial pH of the diluted SSL and the solvent-to-liquid ratio were optimized by applying experimental design. At the optimum conditions (pH value of the aqueous phase equal to 2.22 and a solvent-to-liquid ratio of 3.67:1) the highest total phenolic content in the extract was obtained (7.5 g gallic acid equivalents per L SSL). The extract showed strong antioxidant activity (Antioxidant activity index of 3.64). The main phenolic compounds identified were ellagic and gallic acids. The removal of phenolic compounds from SSL led to higher succinic acid production efficiency by both Actinobacillus succinogenes and Basfia succiniciproducens than in the case that untreated SSL was employed as fermentation substrate. The results indicated that the effective removal of the phenolic compounds could result in a value-added product and at the same time this process could lead to a detoxified fermentation medium, suitable for the biotechnological production of succinic acid. SSL has been effectively fractionated into lignosulphonates, antioxidants and a sugar-rich substrate for bio-based succinic acid production. Initially, solvent extraction using acetone and isopropanol was tested in order to remove the lignosulphonates from SSL. Isopropanol was proved to be a more suitable solvent as it led to the separation of approximately 80% of the total lignosulphonates content. The fed-batch fermentations carried out using the pretreated SSL with isopropanol resulted in a final succinic acid concentration of 19 g/L using both A. succinogenes and B. succiniciproducens. Fractionation of SSL via nanofiltration for lignosulphonate separation and solvent extraction with ethyl acetate for the removal of phenolic compounds produced a detoxified sugar-rich stream that led to the production of 39 g/L of succinic acid by the strain B. succiniciproducens. This fractionation scheme resulted also in the production of 28.1 g lignosulphonates and 1.15 g phenolic-rich extract per 100 g of SSL. Both pretreatment schemes separated significant quantities of heavy metals. This novel biorefinery concept could be integrated into conventional acidic sulphite pulping mills. In order to achieve higher final succinic acid concentrations, cell immobilisation was also tested, using two immobilisation supports, namely: delignified cellulosic material (DCM) and alginate beads. Fed-batch immobilized cultures with A. succinogenes in alginates resulted in higher sugar to succinic acid conversion yield (0.81 g/g) than the respective yield achieved (0.65 g/g) when DCM immobilized cultures were used. The final succinic acid concentration and yield achieved in fed-batch immobilized cultures of B. succiniciproducens in alginates (45 g/L and 0.66 g/g) were higher than A. succinogenes immobilized cultures (35.4 g/L and 0.61 g/g) using nanofiltrated SSL as fermentation medium. Immobilized cultures of B. succiniciproducens in alginate beads were reused in four sequential fed-batch fermentations of nanofiltrated SSL leading to the production of 64.7 g of succinic acid with a yield range of 0.42-0.67 g/g and productivity range of 0.29-0.65 g/L/h. The immobilized cultures improved the efficiency of succinic acid production as compared to free cell cultures. Besides SSL, sugar beet pulp (SBP), a by-product stream derived from the sugar industry, was also evaluated for succinic acid production and extraction of value-added products. SBP contains cellulose, hemicellulose, pectins, and phenolic compounds. Fractionation started with the removal of phenolic compounds using solvent extraction with an aqueous ethanol solution. Subsequently, pectins were separated from SBP by precipitation. The remaining solids were subjected to acid pretreatment with H2SO4 and enzymatic hydrolysis (with the commercial enzyme preparation Accellerase 1500) in order to obtain a sugar-rich hydrolysate that could be used as fermentation substrate. Solid loading, duration of acid hydrolysis and enzyme loading were evaluated. At the optimum conditions (10% solids, 0.5% H2SO4, 30 min at 121 oC and 0.5 mL Accellerase per g cellulose) the SBP hydrolysate contained 40 g/L of reducing sugars, mainly glucose and arabinose. The performance of A. succinogenes and B. succiniciproducens regarding succinic acid production using the sugars present in the hydrolysate was evaluated. A. succinogenes was a more efficient strain than B. succiniciproducens regarding succinic acid production when SBP-derived hydrolysates were used. Fed-batch fermentations with A. succinogenes carried out in lab-scale bioreactors resulted in 30 g/L of succinic acid concentration with a yield of 0.94 g/g and productivity of 0.83 g/L/h. The process was successfully scaled-up to 50 L bioreactor volume with comparable results to the lab-scale fermentations. The downstream separation and purification of bio-based succinate from the fermentation broths has been evaluated using five different downstream processes, namely calcium precipitation, salting-out, direct crystallisation with acidification or cation exchange resins, reactive extraction, and bipolar electrodialysis. Among the evaluated downstream separation schemes, the most promising one was direct crystallisation with cation-exchange resins, which led to a succinic acid recovery yield of 79% and a purity of succinic acid crystals of 96%, while reactive extraction led to a succinic acid recovery yield of 73% and a purity of 97.2%.

Ο σκοπός της διατριβής έγκειται στην αξιολόγηση δύο διαφορετικών βιομηχανικών παραπροϊόντων ως θρεπτικά μέσα ζύμωσης για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος και για την εκχύλιση φαινολικών καθώς και άλλων προϊόντων προστιθέμενης αξίας. Η αποτελεσματική κλασμάτωση αυτών των παραπροϊόντων θα μπορούσε να οδηγήσει στη δημιουργία καινοτόμων βιοδιυλιστηρίων. Το απόβλητο της βιομηχανίας χαρτοπολτού (spent sulphite liquor-SSL), προκύπτει από την όξινη επεξεργασία του ξύλου (εν προκειμένω του δέντρου Eucalyptus globulus) με χρήση θειωδών. Το SSL περιέχει σάκχαρα τα οποία προκύπτουν από την υδρόλυση της ημικυτταρίνης (με κυριότερο σάκχαρο την ξυλόζη), λιγνοσουλφονικά, φαινολικά, οξικό οξύ και άλλες ουσίες οι οποίες μπορούν να δράσουν σαν παρεμποδιστές κατά τη ζύμωση του αποβλήτου από μικροοργανισμούς. Αρχικά μελετήθηκε η εκχύλιση των φαινολικών συστατικών του SSL χρησιμοποιώντας τη μέθοδο εκχύλισης υγρού-υγρού με τη χρήση οξικού αιθυλεστέρα ως διαλύτη εκχύλισης. Ακολούθησε η βελτιστοποίηση των κυριότερων παραμέτρων που επηρρεάζουν την εκχύλιση των φαινολικών όπως η αρχική τιμή pH του αραιωμένου SSL καθώς επίσης και η αναλογία διαλύτη-SSL χρησιμοποιώντας παραγοντικό σχεδιασμό. Στις βέλτιστες συνθήκες (σε τιμή pH της υδατικής φάσης ίσης με 2,22 και αναλογίας διαλύτη-SSL ίσης με 3,67: 1) επιτεύχθηκε η πιο αποτελεσματική εκχύλιση φαινολικών συστατικών με συγκέντρωση ολικών φαινολικών ίση με 7,5 g σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος ανά λίτρο SSL. Το ελλαγικό και το γαλλικό οξύ ήταν τα κυριότερα φαινολικά που ταυτοποιήθηκαν στο εκχύλισμα. Η απομάκρυνση των φαινολικών από το SSL οδήγησε στην επίτευξη υψηλότερης παραγωγής ηλεκτρικού οξέος από τα στελέχη Actinobacillus succinogenes και Basfia succiniciproducens σε σχέση με τις ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν με SSL χωρίς κάποια προεπεξεργασία. Τα πειραματικά αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η απομάκρυνση των φαινολικών συστατικών του SSL οδηγεί όχι μόνο στην παραγωγή ενός προϊόντος προστιθέμενης αξίας όπως τα φαινολικά αλλά ταυτόχρονα συμβάλει στη δημιουργία ενός λιγότερο τοξικού υποστρώματος, κατάλληλου για την βιοτεχνολογική παραγωγή ηλεκτρικού οξέος. Στη συνέχεια μελετήθηκε η δημιουργία βιοδιυλιστηρίου μέσω της κλασμάτωσης του SSL σε λιγνοσουλφονικά, φαινολικά συστατικά και ενός ρεύματος πλούσιου σε σάκχαρα κατάλληλου για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος. Σε πρώτο επίπεδο μελετήθηκε η απομάκρυνση των λιγνοσουλφνικών με τη μέθοδο της εκχύλισης υγρού-υγρού χρησιμοποιώντας ακετόνη και ισοπροπανόλη ως διαλύτες. Η ισοπροπανόλη αποδείχθηκε πιο αποτελεσματικός διαλύτης καθώς η χρήση της οδήγησε στην απομάκρυνση περίπου 80% των ολικών λιγνοσουλφονικών του δείγματος. Το υπόστρωμα που προέκυψε μετά την απομάκρυνση των λιγνοσουλφνικών χρησιμοποιήθηκε σε ζυμώσεις ημισυνεχούς λειτουργίας με τα στελέχη A. succinogenes και B. succiniciproducens οδηγώντας στην παραγωγή 19 g/L ηλεκτρικού οξέος και στις δύο περιπτώσεις. Από την άλλη πλευρά, μελετήθηκε η χρήση υποστρώματος που προέκυψε μετά την απομάκρυνση από το SSL των λιγνοσουλφονικών με τη μέθοδο της νανοδιήθησης σε συνδυασμό με την εκχύλιση των φαινολικών συστατικών η οποία οδήγησε στην παραγωγή 39 g/L ηλεκτρικού οξέος από το στέλεχος B. succiniciproducens. Το ισοζύγιο μάζας για τη συγκεκριμένη μέθοδο έδειξε ότι είναι δυνατή όχι μόνο η επίτευξη υψηλών συγκεντρώσεων ηλεκτρικού οξέος αλλά και ταυτόχρονη παραγωγή 28,1 g λιγνοσουλφονικών καθώς επίσης και 1,15 g εκχυλίσματος πλούσιου σε φαινολικά συστατικά από κάθε 100 g SSL. Μια σημαντική ποσότητα βαρέων μετάλλων απομακρύνθηκε από το SSL είτε με τη χρήση νανοδιήθησης είτε με τη χρήση εκχύλισης με ισοπροπανόλη. Αυτό το καινοτόμο βιοδιυλιστήριο θα μπορούσε να ενσωματωθεί στις σημερινές συμβατικές βιομηχανίες παρασκευής χαρτιού που βασίζονται στη μέθοδο της όξινης επεξεργασίας του ξύλου με θειώδη. Προκειμένου να αυξηθεί η τελική συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος μελετήθηκε η χρήση ακινητοποιημένων βιοκαταλυτών σε υποστρώματα ακινητοποίησης όπως απολιγνινοποιημένα κυτταρινούχα υλικά (ΑΚΥ) και σφαιρίδια αλγνινικών. Η χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων του A. succinogenes σε αλγνικά οδήγησε στην επίτευξη υψηλότερης απόδοσης μετατροπής σακχάρων προς ηλεκτρικό οξύ (0,81 g/g) σε σχέση με τη χρήση ακινητοποιημένου βιοκαταλύτη σε ΑΚΥ (0,65 g/g). Η τελική συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος καθώς και η απόδοση που επιτεύχθηκε από τις ακινητοποιημένες καλλιέργειες του στελέχους B. succiniciproducens σε αλγνικά (45 g/L και 0,66 g/g) ήταν υψηλότερες σε σχέση με τις αντίστοιχες τιμές που προέκυψαν από το στέλεχος A. succinogenes σε αλγνικά (35,4 g/L και 0,61 g/g) χρησιμοποιώντας επεξεργασμένο με νανοδιήθηση SSL ως θρεπτικό μέσο ζύμωσης. Ακινητοποιημένες καλλιέργειες του στελέχους B. succiniciproducens σε αλγνικά επαναχρησιμοποιήθηκαν σε τέσσερεις συνεχόμενες ζυμώσεις ημι-συνεχούς λειτουργίας με SSL επεξεργασμένο με νανοδιήθηση, οδηγώντας στη συνολική παραγωγή 64,7 g ηλεκτρικού οξέος με την απόδοση του προϊόντος να κυμαίνεται μεταξύ 0,42-0,67 g/g και παραγωγικότητα μεταξύ 0,29-0,65 g/L/h. Οι ακινητοποιημένες καλλιέργειες βελτίωσαν την αποδοτικότητα της παραγωγής ηλεκτρικού οξέος σε σχέση με τις καλλιέργειες ελεύθερων κυττάρων. Εκτός από το SSL, μελετήθηκε επίσης η αξιοποίηση ενός ακόμα σημαντικού παραπροϊόντος που προκύπτει από τη βιομηχανία ζάχαρης, της πούλπας από σακχαρότευτλα (ή ζαχαρόπιτα). Η πούλπα από σακχαρότευτλα περιέχει κυτταρίνη, ημικυτταρίνη, πηκτίνες και φαινολικά. Η κλασμάτωση του συγκεκριμένου αποβλήτου ξεκίνησε με τον διαχωρισμό των φαινολικών συστατικών χρησιμοποιώντας τη μέθοδο εκχύλισης με υδατικό διάλυμα αιθανόλης. Ακολούθησε κατακρήμνιση των πηκτινών και τα υπολειπόμενα στερεά υδρολύθηκαν αρχικά με τη χρήση διαλύματος H2SO4 και έπειτα με ένζυμα (με τη χρήση του εμπορικού μείγματος ενζύμων Accellerase 1500), με στόχο την παραγωγή ενός υποστρώματος πλούσιου σε σάκχαρα, κατάλληλου για ζυμώσεις ηλεκτρικού οξέος. Η συγκέντρωση των στερεών της υδρόλυσης, η διάρκεια της όξινης υδρόλυσης καθώς και η κατάλληλη συγκέντρωση ενζύμων αποτέλεσαν τις κύριες παραμέτρους που μελετήθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν. Υπό τις βέλτιστες συνθήκες (10% συγκέντρωση στερεών, 0,5% H2SO4, 30 λεπτά υδρόλυσης στους 121 oC και 0,5 mL Accellerase ανά g κυτταρίνης) το υδρόλυμα που προέκυψε περιείχε 40 g/L σάκχαρα, κυρίως γλυκόζη και αραβινόζη. Εν συνεχεία αξιολογήθηκε η ικανότητα παραγωγής ηλεκτρικού οξέος από τα στελέχη A. succinogenes και B. succiniciproducens χρησιμοποιώντας τα σάκχαρα του υδρολύματος ως πηγή άνθρακα. Το στέλεχος A. succinogenes έδωσε καλύτερα αποτελέσματα όσον αφορά την τελική συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος σε σχέση με το στέλεχος B. succiniciproducens σε καλλιέργειες διαλείποντος έργου με υδρόλυμα της πούλπας από σακχαρότευτλα ως θρεπτικό μέσο ζύμωσης. Ζυμώσεις ημι-συνεχούς λειτουργίας με το στέλεχος A. succinogenes που πραγματοποιήθηκαν σε εργαστηριακή κλίμακα, οδήγησαν στην παραγωγή 30 g/L ηλεκτρικού οξέος με απόδοση 0,94 g/g και παραγωγικότητα ίση με 0,83 g/L/h. Η διεργασία που αναπτύχθηκε εργαστηριακά μεταφέρθηκε επιτυχώς σε πιλοτική κλίμακα με την πραγματοποίηση ζυμώσεων ημισυνεχούς λειτουργίας σε βιοαντιδραστήρα χωρητικότητας 50 L οι οποίες έδωσαν συγκρίσιμα αποτελέσματα με τις ζυμώσεις σε εργαστηριακή κλίμακα. Ο διαχωρισμός και ο καθαρισμός του βιοτεχνολογικά παραγώμενου ηλεκτρικού οξέος μελετήθηκε με την αξιολόγηση πέντε διαφορετικών μεθόδων: με κατακρήμνιση με τη χρήση ασβεστίου, με εξαλάτωση, με απευθείας κρυστάλλωση είτε με οξίνιση του μέσου είτε με τη χρήση κατιονανταλλακτικών ρητινών, με εκχύλιση χρησιμοποιώντας αμίνες σε οργανικούς διαλύτες και με τη μέθοδο της ηλεκτροδιάλυσης. Από όλες τις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν η μέθοδος της απευθείας κρυστάλλωσης με τη μέθοδο των κατιονανταλλακτικών ρητινών έδωσε τα καλύτερα αποτελέσματα, καθώς η απόδοση ανάκτησης του ηλεκτρικού οξέος ήταν της τάξεως του 79% με καθαρότητα 96%, ακολουθούμενη από τη μέθοδο εκχύλισης με τη χρήση αμινών σε οργανικό διαλύτη με την οποία ανακτήθηκε το 73% του ηλεκτρικού οξέος από το θρεπτικό μέσο με καθαρότητα 97,2%.