Bioprocess development for the production of 1,3-propanediol and 2,3-butanediol using food waste and crude renewable resources from biodiesel and cane sugar production processes

Abstract

The development of a bio-based and circular economy has been identified as a necessary step to achieve the successful transition into a sustainable economy independent of fossil resources. The development of novel sustainable technologies is required for efficient conversion of renewable raw materials into bio-based chemicals, polymers, fuels and energy. This thesis presents novel research on bioprocess development for the production of 1,3-propanediol (PDO), 2,3-butanediol (BDO) and acetoin from food waste and crude renewable resources from biodiesel and cane sugar production plants. The aforementioned bio-based chemicals could be used as additives in high-value applications (e.g. flavour and fragrances) or precursors for the production of bio-based polymers and commodity products. Soybean cake (SBC) and crude glycerol, produced as by-products from biodiesel production processes using soybean as feedstock, were used as sole raw materials for PDO production using two bacterial strains of Citrobacter freundii. SBC was converted into a nutrient-rich hydrolysate by crude enzymes produced via solid state fermentation. The effect of initial glycerol and free amino nitrogen concentration on bacterial growth and PDO production was evaluated in batch bioreactor cultures showing that C. freundii VK-19 is a more efficient PDO producer than C. freundii FMCC-8. The cultivation of C. freundii VK-19 in fed-batch bioreactor cultures using crude glycerol and SBC hydrolysates led to PDO concentration of 47.4 g L-1 with yield and productivity of 0.49 g g-1 and 1.01 g L-1 h-1, respectively. The effect of PDO, metabolic by-products and sodium and potassium salts on bacterial growth was evaluated showing that potassium salts initially enhance bacterial growth, whereas sodium salts cause significant inhibition to bacterial growth. Different crude glycerols, derived from a biodiesel production plant using either soybean oil alone or two mixtures of soybean oil and tallow fat as feedstocks, were evaluated for BDO production by Klebsiella michiganensis. The effect of nitrogen source, temperature and initial glycerol concentration on bacterial growth and BDO production was studied in shake flask cultures. Using a synthetic medium with ammonium sulphate as nitrogen source favoured BDO production. The optimum temperature was 30 ˚C. The bacterial strain K. michiganensis could grow and produce BDO even at high initial crude glycerol concentrations when this stream was derived from biodiesel production using only soybean oil. BDO production by K. michiganensis was subsequently evaluated in fed-batch bioreactor fermentations using different types of crude glycerol and various volumetric oxygen transfer coefficients (kLa). The highest BDO concentration (87.6 g L-1) was reached using crude glycerol produced from soybean oil derived biodiesel with constant kLa value of 62 h-1 during fermentation. The highest productivity (1.38 g L-1 h-1) with reasonable BDO concentration (76.1 g L-1) and yield (0.41 g g-1) were reached when the same glycerol and kLa value of 77 h-1 were used. Lower BDO production efficiency was achieved with crude glycerols derived from biodiesel production with soybean oil and tallow fats as feedstock. The production of D-BDO and acetoin using the GRAS strain Bacillus amyloliquefaciens from very high polarity (VHP) cane sugar and sugarcane molasses has been evaluated. The effect of initial substrate concentration, nitrogen source, temperature, inoculum size and pH has been evaluated in shake flask cultures. Batch bioreactor cultures showed that D-BDO production (up to 28 g L-1) with high yield (up to 0.43 g g-1) and productivity (up to 0.93 g L-1 h-1) was favored at low kLa values (17 – 49 h-1). Increasing kLa values (63 – 104 h-1) caused metabolic shift towards acetoin production (up to 25.6 g L-1) with yields up to 0.4 g g-1 and productivities up to 1.42 g L-1 h-1. Fed-batch fermentation carried out at kLa value of 49 h-1 with VHP cane sugar resulted in mixed production (127.3 g L-1) of D-BDO, meso-BDO and acetoin at 122 h with high yield (0.50 g g-1) and productivity (1.04 g L-1 h-1). In a similar fed-batch fermentation with sugarcane molasses, mainly D-BDO production (48.7 g L-1 with purity of 87.8%) was achieved at 59 h with yield of 0.40 g g-1 and productivity of 0.83 g L-1 h-1. At 130 h, D-BDO was converted mainly into acetoin (55.4 g L-1). Fed-batch cultures with sugarcane molasses could lead to either D-BDO or acetoin production with negligible by-product formation. The GRAS strain B. amyloliquefaciens was also evaluated for D-BDO and acetoin production using enzymatically produced bakery waste hydrolysates in bench top and pilot scale bioreactors. Manipulation of kLa during fermentation may control metabolic shift in B. amyloliquefaciens cells towards either D-BDO or acetoin production. Batch cultures with kLa value of 64 h-1 led to the highest D-BDO concentration (55.2 g L-1) with a yield of 0.42 g g-1. The highest acetoin concentration (47.4 g L-1) with productivity of 2.16 g L-1 h-1 was achieved in batch cultures with the highest kLa value (203 h-1) used. It was verified that kLa can be used as scale-up parameter for conducting fermentations in 50 L bioreactor scale. Fed-batch fermentation may increase further D-BDO and acetoin production efficiency.

H παραγωγή προϊόντων βιο-οικονομίας αποτελεί μια νέα αναπτυξιακή στρατηγική για τη μετάβαση προς μια βιώσιμη και ενεργειακά ανεξάρτητη από ορυκτά καύσιμα οικονομία. Η ανάπτυξη καινοτόμων και αειφόρων τεχνολογιών απαιτείται για τη χρήση ανανεώσιμων πρώτων υλών προς την παραγωγή χημικών ουσιών, πολυμερών, καυσίμων και ενέργειας. Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στην ανάπτυξη βιοδιεργασιών βασισμένων στη βιομηχανική βιοτεχνολογία για την παραγωγή 1,3-προπανοδιόλης (PDO), 2,3-βουτανοδιόλης (BDO) και ακετοΐνης με χρήση αποβλήτων τροφίμων και ακατέργαστων ανανεώσιμων πρώτων υλών από βιομηχανίες παραγωγής βιοντήζελ και ζάχαρης από ζαχαροκάλαμο. Σογιάλευρα και ακατέργαστη γλυκερόλη που παράγονται ως παραπροϊόντα από διεργασίες παραγωγής βιοντήζελ χρησιμοποιήθηκαν ως πρώτες ύλες για την παραγωγή PDO μέσω ζύμωσης με δύο βακτηριακά στελέχη Citrobacter freundii. Τα σογιάλευρα χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή υδρολύματος πλούσιου σε θρεπτικά συστατικά με χρήση ακατέργαστων ενζύμων που παρήχθησαν μέσω ζύμωσης στερεάς κατάστασης. Η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης γλυκερόλης και του αζώτου των ελευθέρων αμινομάδων αμινοξέων και πεπτιδίων στην μικροβιακή ανάπτυξη και στην παραγωγή PDO μελετήθηκε σε καλλιέργειες διαλείποντος έργου. Ικανοποιητική παραγωγή PDO σημειώθηκε από το βακτηριακό στέλεχος C. freundii VK-19 συγκριτικά με το C. freundii FMCC-8. Η πραγματοποίηση ζυμώσεων ημι-διαλείποντος έργου με χρήση ακατέργαστης γλυκερόλης και υδρολύματος σογιάλευρου οδήγησε στην παραγωγή 47,4 g L-1 PDO με απόδοση 0,49 g g-1 και παραγωγικότητα 1,01 g L-1 h-1. Τα άλατα καλίου αρχικά αύξησαν την μικροβιακή ανάπτυξη, ενώ τα άλατα νατρίου προκαλούν σημαντική παρεμπόδιση της μικροβιακής ανάπτυξης. Η παραγωγή BDO με χρήση διαφορετικών ακατέργαστων γλυκερολών μελετήθηκε χρησιμοποιώντας το βακτηριακό στέλεχος Klebsiella michiganensis. Μελετήθηκε η επίδραση της πηγής αζώτου, της θερμοκρασίας και της αρχικής συγκέντρωσης γλυκερόλης δείχνοντας ότι η ανόργανη πηγή αζώτου και η θερμοκρασία των 30 ˚C μεγιστοποιούν την παραγωγή BDO. Το βακτηριακό στέλεχος Κ. michiganensis αναπτύσσεται και παράγει BDO ακόμα και σε υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις ακατέργαστης γλυκερόλης. Ακολούθως, μελετήθηκε η παραγωγή BDO μέσω ζυμώσεων ημι-διαλείποντος έργου που πραγματοποιήθηκαν υπό διαφορετικές τιμές kLa και τύπους ακατέργαστων γλυκερολών. Η υψηλότερη συγκέντρωση BDO (87,8 g L-1) παρήχθη με χρήση τιμής kLa ίσης με 62 h-1. Η μεγαλύτερη παραγωγικότητα (1,38 g L-1 h-1) με συγκέντρωση BDO ίσης με 76,1 g L-1 και απόδοσης ίσης με 0,41 g g-1 επιτεύχθηκε σε τιμή kLa ίσης με 77 h-1. Η χρήση ακατέργαστης γλυκερόλης προερχόμενη από μείγμα σογιελαίου και ζωικού λίπους είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της παραγωγής BDO. Ακατέργαστη ζάχαρη και μελάσα μελετήθηκαν ως πρώτες ύλες για την παραγωγή D-BDO και ακετοΐνης από το βακτηριακό στέλεχος Bacillus amyloliquefaciens. Αρχικά, μελετήθηκε η επίδραση της πηγής αζώτου, της θερμοκρασίας, του εμβολίου, της παροχής οξυγόνου και του pΗ στη μικροβιακή αύξηση και στην παραγωγή μεταβολικών προϊόντων μέσω ζυμώσεων σε αναδευόμενες φιάλες. Ζυμώσεις διαλείποντος έργου σε βιοαντιδραστήρα σε μικρές τιμές kLa (17 – 49 h-1) ευνοούν την παραγωγή D-BDO, ενώ υψηλότερες τιμές kLa (63 – 104 h-1) ευνοούν την παραγωγή ακετοΐνης. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις ημι-διαλείποντος έργου χρησιμοποιώντας ακατέργαστη ζάχαρη και μελάσα. Η χρήση διαφορετικών διαλυμάτων τροφοδοσίας οδήγησε σε διαφορετική αναλογία των ισομερών της BDO και της ακετοΐνης κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Η χρήση ακατέργαστης μελάσας οδήγησε στην παραγωγή κυρίως D-BDO (48,7 g L-1 με καθαρότητα 87,8%) στις 59 h ζύμωσης με απόδοση 0,40 g g-1 και παραγωγικότητα 0,83 g L-1 h-1. Στις 130 h, η D-BDO μετατράπηκε κυρίως σε ακετοΐνη (55,4 g L-1). Πραγματοποίηση ζύμωσης με αποκλειστική χρήση μελάσας οδήγησε στην παραγωγή είτε D-BDO είτε ακετοΐνης, ενώ ταυτόχρονα δεν παρατηρήθηκε παραγωγή άλλων μεταβολικών προϊόντων. Το βακτηριακό στέλεχος Bacillus amyloliquefaciens αξιολογήθηκε ως προς την παραγωγή D-BDO και ακετοΐνης με χρήση υδρολύματος από απόβλητα αρτοποιίας που παρήχθη με χρήση ενζύμων. Η μεταβολή της τιμής του kLa κατά τη διάρκεια της ζύμωσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να στρέψει το μεταβολισμό του B. amyloliquefaciens προς την παραγωγή είτε D-BDO είτε ακετοΐνης. Ζυμώσεις διαλείποντος έργου σε εργαστηριακό βιοαντιδραστήρα και τιμή kLa ίσης με 64 h-1 είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή της υψηλότερης συγκέντρωσης D-BDO (55,1 g L-1) με απόδοση 0,42 g g-1. Η μεγαλύτερη συγκέντρωση ακετοΐνης (47,4 g L-1) και παραγωγικότητας (2,31 g L-1 h-1) επετεύχθη σε ζυμώσεις διαλείποντος έργου με τιμή kLa ίσης με 203 h-1. Τα πειραματικά αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι το kLa μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αύξηση κλίμακας ζυμώσεων σε βιοαντιδραστήρα 50 λίτρων. Η πραγματοποίηση ζυμώσεων ημι-διαλείποντος έργου δύναται να αυξήσει την παραγωγή D-BDO και ακετοΐνης.