Development of microbial and enzymatic processes for valorisation of industrial side streams for the production of microbial lipids and esters

Abstract

This doctoral dissertation focused on the valorisation of renewable resources including liquid and solid industrial waste and by-products streams for the biotechnological production of value-added products. Their potential utilisation as raw materials for the chemical industry was evaluated. Extraction of phenolic compounds from by-product streams of palm oil production was assessed in terms of total phenolic content and antioxidant activity index. Phenolics incorporation into various edible oils aimed to prolong their shelf life. The first part of this thesis demonstrated the production of a generic nutrient-rich feedstock using by-product streams from palm oil production as a substitute for commercial fermentation supplements. Solid-state fermentations of palm kernel cake (PKC) and palm-pressed fiber (PPF) were conducted in tray bioreactors and a rotating drum bioreactor by the fungal strain Aspergillus oryzae for the production of crude enzymes. The production of protease was optimized (319.3 U/g) at an initial moisture content of 55%, when PKC was used as the sole substrate. The highest free amino nitrogen (FAN) production (5.6 mg/g) obtained via PKC hydrolysis using the crude enzymes produced via solid-state fermentation was achieved at 50 °C. Three initial PKC concentrations were tested in hydrolysis experiments, leading to total Kjeldahl nitrogen to FAN conversion yields up to 27.9%. Sequential solid-state fermentation followed by hydrolysis, was carried out in the same rotating drum bioreactor, leading to the production of 128.8 U/g of protease activity during fermentation and 201.5 mg/L of FAN during hydrolysis. Microbial oil production was successfully achieved with the oleaginous yeast strain Lipomyces starkeyi DSM 70296 cultivated on the produced PKC hydrolysate mixed with commercial carbon sources, including glucose, xylose, mannose, galactose, and arabinose. A sequential part of the thesis, dealt with the extraction of phenolic compounds from various side streams derived from palm oil production including PKC, PPF, palm kernel shells (PKS) and empty fruit bunches (EFB). Among these streams, PKC showed the highest total phenolic content with a value of 5.2 mg of gallic acid equivalents (GAE)/g of dry sample, whereas the EFB presented the lowest value (1.8 mg GAE/g dry sample). The extraction time as well as the liquid-to-solid ratio were investigated to optimize the phenolic extraction. PKC exhibited the highest total phenolic content (5.4 mg GAE/g dry sample) with a liquid-to-solid ratio of 40:1 during 20 minutes of extraction. The main phenolic compounds of the extracts deriving from all by-product streams were also identified and quantified employing HPLC-DAD. Catechin and 4-hydroxybenzoic acid were detected in all samples. The addition of 0.8% of PKC extract increased more than 50 % the induction time of sunflower oil. A subsequent objective of this study was the valorisation of various protein-rich agricultural residues for the production of microbial oil-based polyol esters with lubrication properties. Palm kernel cake was initially used as substrate to evaluate lipid production via solid state fermentations using the fungal strains Cunninghamella echinulata, Mortierella ramanniana sp., Mortierella isabellina and Thamnidium elegans. Based on fermentation efficiency and fatty acid composition, C. echinulata was selected for further optimisation of fermentative conditions (i.e. temperature, initial moisture content, ratio of palm kernel cake and palm pressed fiber). Under the optimum conditions, microbial oil production in tray fermentations was 129.1 mg/g of fermented solids (gfs), with a γ-linolenic content of 5.3% (w/w). Cotton seed cake and castor seed cake were also evaluated for microbial lipid production in tray fermentations. The highest biomass production (304.1 mg/gfs) with a lipid content of 40.1% (w/w) was achieved when cotton seed cake was used. Subsequently, microbial lipid production using cotton seed cake was also evaluated in packed bed bioreactors, leading to a fungal biomass production of 320.5 mg/gfs with an intracellular lipid content of 37.7% (w/w). The microbial oil was extracted from the fermented solids and used for polyol ester production catalyzed by Lipomod 34MDP in a solvent free system. The highest conversion yield of 80% was achieved after 2 h reaction. The produced esters were characterized via Nuclear Magnetic Resonance analysis. The present study showed the perspective of valorising agricultural residues into value added oleochemicals with potential use as biolubricants. Next, spent sulphite liquor (SSL), the major waste stream of pulp and paper industry, was valorized for the production of microbial oil rich in γ-linolenic acid (GLA) by five oleaginous fungi of the genus Mortierella sp., Cunninghmamella sp. and Thamnidium sp. The aim was the utilization of fungal oil as substrate for the enzymatic synthesis of isopropyl and 2-ethylhexanol esters employing a solvent-free system catalyzed by commercial lipases. The reaction conditions evaluated, were temperature (30 - 70 ○C), microbial oil to alcohol molar ratio (1:2.84 - 1:4) and biocatalyst amount (5 - 20%, w/w). Under the optimized conditions, subsequent transesterifications were conducted using lipid classes obtained via fractionation of microbial oil, including neutral lipids (NL), glycolipids and sphingolipids (GL+SL) and phospholipids (PL). Results showed that the presence of GL+SL and PL fractions negatively affected the enzymatic synthesis of the esters. Transesterification of the NL fraction with isopropanol and 2-ethylhexanol led to the maximum conversion yield of 80.2% and 73.8%, respectively. Subsequently, the conversion yield was maximized (90% and 80% for isopropyl and 2-ethylhexyl esters respectively) by the utilization of hydrolyzed microbial oil. The reuse and stability of biocatalyst in 6 repeated reactions as well as the physicochemical properties of the produced esters were also evaluated using the hydrolyzed microbial oil. The present study demonstrates the perspective of utilizing renewable resources for the production of specialty fatty acid esters rich in GLA with potent application in food, cosmetics and oleochemicals industries. The last part of the thesis was related to the exploitation of SSL as the sole carbon source for the production of microbial oil. Initially, the effect of different C/FAN ratios and lignosulphonates (LS) concentrations on microbial oil production and fatty acid composition by Lipomyces starkeyi, Cunnighamella echinulata and Mortierella isabellina was evaluated in shake flasks fermentations. The highest lipid and total dry weight (TDW) production of L. starkeyi was 11.2 g/L and 2.8 g/L, respectively, using at C/FAN ratio of 173. In fed-batch fermentation, L. starkeyi showed the highest lipid production (40.9 g/L) at a C/FAN ratio of 33. In shake flask fermentations of M. isabellina, biomass production and microbial oil content were highly inhibited when 10 g/L and 50 g/L of LS were added in the fermentation media. In the case of C. echinulata, lipid and GLA contents were positively affected with increasing C/FAN ratios (until a threshold), leading to the highest values of 60% and 18.8%, respectively. A simultaneous phenolic removal (61%) of the substrate was also observed by the fungal strain in this case. TDW seemed to be induced while GLA formation was significantly decreased (8.9%) with increasing LS concentration. Fed-batch cultures of C. echinulata in bioreactor resulted in TDW production of 12.2 g/L with a lipid content of 56% in a media containing 5 g/L LS. Fermentation efficiency was significantly affected in the case of 90 g/L LS leading to reduced TDW production (9.9 g/L) and lipid content (27%). Fed-batch experiments demonstrated that GLA formation was strongly affected probably due to the applied aeration and agitation.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στην αξιοποίηση των ανανεώσιμων πρώτων υλών, συμπεριλαμβανομένων υγρών και στερεών βιομηχανικών αποβλήτων και υποπροϊόντων για τη βιοτεχνολογική παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Αξιολογήθηκε η πιθανή αξιοποίησή τους ως πρώτη ύλη για τη χημική βιομηχανία όπως εστέρες με εφαρμογές στον τομέα των καλλυντικών και εστέρες με βιολιπαντικές ιδιότητες. Η εκχύλιση των φαινολικών ενώσεων από τα ρεύματα υποπροϊόντων από την παραγωγή φοινικέλαιου αξιολογήθηκε ως προς τη συγκέντρωση ολικών φαινολικών και την αντιοξειδωτική τους ικανότητα. Η ενσωμάτωση φαινολικών σε διάφορα βρώσιμα έλαια είχε ως στόχο την παράταση της διάρκειας ζωής τους. Το πρώτο μέρος της διατριβής επικεντρώθηκε στην αξιοποίηση παραπροϊόντων από την παραγωγή φοινικέλαιου προς παραγωγή υποστρώματος ζύμωσης πλούσιου σε θρεπτικά συστατικά με σκοπό να αντικαταστήσει εμπορικά θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιούνται στις συμβατικές βιομηχανικές ζυμώσεις. Οι ζυμώσεις στερεάς κατάστασης χρησιμοποιώντας φυτικές ίνες μεσοκαρπίου μετά την εξαγωγή του φοινικέλαιου (palm pressed fibers-PPF) και άλευρα ενδοσπερμίου μετά την εξαγωγή του πυρηνέλαιου (palm kernel cake-PKC) με το στέλεχος του μύκητα Aspergillus oryzae διεξήχθησαν σε κωνικές φιάλες των 250 mL. Στόχος ήταν η ανάπτυξη της ενζυμικής διεργασίας για την παραγωγή πρωτεολυτικών ενζύμων. Η παραγωγή πρωτεολυτικών ενζύμων βελτιστοποιήθηκε (319,3 U/g) σε αρχική υγρασία στερεού 55%, όταν το PKC χρησιμοποιήθηκε ως μοναδικό στερεό υπόστρωμα ζύμωσης. Διαδοχικές ζυμώσεις στερεής κατάστασης σε αναλογία PKC:PPF ίσης προς 70:30 πραγματοποιήθηκαν σε 15 L βιοαντιδραστήρα περιστρεφόμενου τυμπάνου οδηγώντας σε πρωτεολυτική ενεργότητα 128,8 U/g. Σε επόμενο στάδιο, τα παραχθέντα ακατέργαστα πρωτεολυτικά ένζυμα χρησιμοποιήθηκαν για την ενζυμική υδρόλυση των πρωτεϊνών που περιέχονται στο PKC με σκοπό την δημιουργία υδρολυμάτων πλούσιων σε άζωτο και θρεπτικά συστατικά. Οι ενζυμικές υδρολύσεις έδειξαν ότι η υψηλότερη παραγωγή αζώτου που περιέχεται στις ελεύθερες αμινομάδες αμινοξέων και πεπτιδίων (free amino nitrogen-FAN) (5,6 mg/g) επιτεύχθηκε με το PKC στους 50 °C. Τρεις αρχικές συγκεντρώσεις PKC εξετάστηκαν, οδηγώντας σε απόδοση μετατροπής ολικού αζώτου (Kjeldahl) προς FAN έως και 27,9%. Ακολούθως, αξιολογήθηκε η ικανότητα της ζύμης Lipomyces starkeyi DSM 70296 να αναπτύσσεται και να παράγει μικροβιακά λιπίδια στα παραχθέντα υδρολύματα του PKC μέσω ασυνεχών υγρών ζυμώσεων και την προσθήκη συνθετικών πηγών άνθρακα όπως αραβινόζη, ξυλόζη, γαλακτόζη, μαννόζη και γλυκόζη. Η παραγωγή μικροβιακής βιομάζας κυμάνθηκε από 20,6 g/L έως 22,4 g/L και η συγκέντρωση λιπιδίων από 5,7 g/L έως 7,3 g/L. Το επόμενο μέρος της διδακτορικής διατριβής αφορούσε στην εκχύλιση φαινολικών ενώσεων από διάφορα παράπλευρα ρεύματα προέρχομενα από τη διεργασία παραγωγής φοινικέλαιου, συμπεριλαμβανομένων των PKC, PPF, άλευρα ενδοκαρπίου (palm kernel shells-PKS) και άδεια τσαμπιά μετά την παραλαβή του φοινικόκαρπου (empty fruit bunches-EFB) και την αξιολόγηση των αντίστοιχων φαινολικών εκχυλισμάτων ως προς την συγκέντρωση ολικών φαινολικών και την αντιοξειδωτική τους ικανότητα. Μεταξύ των ρευμάτων αυτών, το PKC έδειξε την υψηλότερη ολική συγκέντρωση φαινολικών με τιμή 5,2 mg ισοδύναμα γαλλικού οξέος (gallic acid equivalents-GAE)/g ξηρού δείγματος, ενώ τα EFB παρουσίασαν τη χαμηλότερη τιμή (1,8 mg GAE/g). Ο χρόνος εκχύλισης καθώς και ο λόγος διαλύτη εκχύλισης προς στερεό ερευνήθηκαν για τη βελτιστοποίηση της εκχύλισης φαινολικών από το PKC. Οι κύριες φαινολικές ενώσεις των εκχυλισμάτων από όλες τις ροές υποπροϊόντων, ταυτοποιήθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας HPLC-DAD. Το 4- υδροξυβενζοϊκό οξύ και η κατεχίνη ανιχνεύτηκαν σε όλα τα δείγματα. Η μελέτη έδειξε ότι η προσθήκη 0.8% εκχυλίσματος PKC σε ηλιέλαιο οδήγησε σε αύξηση του χρόνου επαγωγής του πάνω από 50%. Στόχος της μελέτης αυτής ήταν επίσης η αξιοποίηση διαφόρων πλούσιων σε πρωτεΐνες γεωργικών υπολειμμάτων για την παραγωγή εστέρων πολυολών με λιπαντικές ιδιότητες από μικροβιακό λίπος. Το PKC χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα για να αξιολογηθεί η παραγωγή μικροβιακού λίπους μέσω ζυμώσεων στερεάς κατάστασης από διάφορα στελέχη μυκήτων όπως Cunninghamella echinulata, Mortierella ramanniana sp., Mortierella isabellina και Thamnidium elegans. Με βάση την αποτελεσματικότητα της ζύμωσης και τη σύνθεση των λιπαρών οξέων, το στέλεχος C. echinulata επιλέχθηκε για περαιτέρω βελτιστοποίηση των συνθηκών ζύμωσης (θερμοκρασία, αρχική περιεκτικότητα σε υγρασία, αναλογία PKC και PPF). Υπό τις βέλτιστες συνθήκες, η παραγωγή μικροβιακού λίπους ανήλθε σε 129,1 mg/g ζυμωθέντων στερεών (fermented solids-fs), με περιεκτικότητα σε GLA 5,3%. Στην συνέχεια, στερεά υπολείμματα βαμβακόσπορου (cotton seed cake-CoSC) και ρίκινου (castor seed cake-CaSC) αξιολογήθηκαν επίσης για παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων σε ζυμώσεις στερεής κατάστασης. Η μέγιστη παραγωγή βιομάζας (304,1 mg/gfs) με περιεκτικότητα λιπιδίων 40,1% επιτεύχθηκε με την χρήση CoSC. Η παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων διεξήχθη επίσης σε βιοαντιδραστήρες σταθερής κλίνης όπου χρησιμοποήθηκε ως στερεό υπόστρωμα ζύμωσης το CoSC. Σε αυτή την περίπτωση, η παραγόμενη μυκητιακή βιομάζα ανήλθε σε 320,5 mg/gfs με περιεχόμενο ενδοκυτταρικών λιπιδίων 37,7%. Το μικροβιακό λίπος εκχυλίστηκε από τα ζυμωμένα στερεά και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για την ενζυμική παραγωγή εστέρων πολυολών σε ένα σύστημα απουσία διαλυτών καταλυόμενο από το ένζυμο Lipomod 34-MDP. Η υψηλότερη απόδοση μετατροπής (80%) επιτεύχθηκε μετά από αντίδραση 2 ωρών. Η παρούσα μελέτη έδειξε την προοπτική αξιοποίησης γεωργικών υπολειμμάτων προς παραγωγή ελαιοχημικών υψηλής προστιθέμενης αξίας με δυνητική χρήση ως εστέρες με βιολιπαντκές ιδιότητες. Ακολούθως, το υγρό απόβλητο από την βιομηχανία χαρτοπολτού και χάρτου (spent sulphite liquor-SSL) αξιοποιήθηκε προς παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων πλούσιων σε GLA, μέσω πέντε μυκήτων του γένους Mortierella sp., Cunninghmamella sp. και Thamnidium sp. Ο στόχος ήταν η χρησιμοποίηση των λιπιδίων ως υποστρώμα για την σύνθεση εστέρων ισοπροπανόλης και 2-αιθυλο-1-εξανόλης σε σύστημα απουσία διαλύτη, καταλυόμενο από εμπορικές λιπάσες (Novozyme 435). Οι συνθήκες αντίδρασης που αξιολογήθηκαν ήταν η αναλογία μικροβιακού λίπους προς αλκοόλη (1 : 2,84 – 1 : 4), η ποσότητα βιοκαταλύτη (5 - 20%, κ.β.) και η θερμοκρασία (30 - 70 °C). Υπό τις βέλτιστες συνθήκες, διεξήχθησαν μετεστεροποιήσεις χρησιμοποιώντας κλάσεις λιπιδίων που λαμβάνονται μέσω κλασμάτωσης, συμπεριλαμβανομένων των ουδέτερων λιπιδίων (neutral lipids-NL), των γλυκολιπιδίων και των σφιγγολιπιδίων (glycolipids and sphingolipids-GL + SL) και των φωσφολιπιδίων (phospholipids-PL). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η παρουσία των GL + SL και PL επηρέασε αρνητικά την ενζυμική σύνθεση των εστέρων. Η μετεστεροποίηση του κλάσματος NL με ισοπροπανόλη και 2-αιθυλεξανόλη οδήγησε στη μέγιστη απόδοση βιομετατροπής 80,2% και 73,8% αντίστοιχα. Στη συνέχεια, η απόδοση βιομετατροπής μεγιστοποιήθηκε (90% και 80% για τους εστέρες ισοπροπανόλης και 2-αιθυλεξανόλης, αντίστοιχα) με τη χρήση υδρολυμένου μικροβιακού ελαίου. Η επαναχρησιμοποίηση και η σταθερότητα του βιοκαταλύτη σε 6 επαναλαμβανόμενες αντιδράσεις καθώς και οι φυσικοχημικές ιδιότητες των παραγόμενων εστέρων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το υδρολυμένο μικροβιακό λίπος. Η παρούσα μελέτη έδειξε την προοπτική χρήσης ανανεώσιμων πρώτων υλών για την παραγωγή εστέρων λιπαρών οξέων πλούσιων σε GLA με πιθανές εφαρμογές σε βιομηχανίες τροφίμων, καλλυντικών και ελαιοχημικών. Το τελευταίο μέρος της διατριβής σχετίζεται με την αξιοποίηση του SSL ως μοναδικής πηγής άνθρακα για την παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων. Αρχικά, μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων αναλογιών άνθρακα:αζώτου και διαφορετικών συγκεντρώσεων λιγνοσουλφονικών ουσιών στην παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων και στην σύσταση των λιπαρών οξέων των μικροβιακών στελεχών L. starkeyi, C. echinulata and M. isabellina σε ζυμώσεις ασυνεχούς καλλιέργειας. Η υψηλότερη παραγωγή λιπιδίων και βιομάζας με το στέλεχος L. starkeyi ήταν 11,2 g/L και 2,8 g/L, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας λόγο άνθρακα:αζώτου 173. Σε μικροβιακές ζυμώσεις ημισυνεχούς λειτουργίας, ο L. starkeyi έδειξε την υψηλότερη συγκέντρωση λιπιδίων (40,9 g/L) σε αναλογία άνθρακα:αζώτου 33. Σε ζυμώσεις ασυνεχούς καλλιέργειας, με τον μύκητα Μ. isabellina, η παραγωγή βιομάζας και η λιποπεριεκτικότητα παρεμποδίστηκαν όταν 10 g/L και 50 g/L λιγνοσουλφονικών ουσιών προστέθηκαν στο θρεπτικό μέσο της ζύμωσης. Στην περίπτωση του μύκητα C. echinulata, η λιποπεριεκτικότητα και το ποσοστό σε GLA ευνοήθηκαν με την αύξηση των αναλογιών άνθρακα:αζώτου (μέχρι ένα όριο), οδηγώντας σε μέγιστες τιμές 60% και 18,8% αντίστοιχα. Ταυτόχρονη απομάκρυνση φαινολικών ουσιών (61%) παρατηρήθηκε από το μυκητιακό στέλεχος στην περίπτωση αυτή. Η παραγόμενη βιομάζα ευνοήθηκε ενώ το ποσοστό των λιπιδίων σε GLA μειώθηκε σημαντικά (8,9%) με την αύξηση της συγκέντρωσης των λιγνοσουλφονικών ουσιών. Οι μικροβιακές ζυμώσεις ημι-συνεχούς λειτουργίας με τον μύκητα C. echinulata είχαν ως αποτέλεσμα την παραγωγή βιομάζας 12,2 g/L με περιεκτικότητα λιπιδίων 56% όταν προστέθηκαν 5 g/L λιγνοσουλφονικά. Η αποτελεσματικότητα της ζύμωσης επηρεάστηκε σημαντικά στην περίπτωση που προστέθηκαν 90 g/L λιγνοσουλφονικών, οδηγώντας σε παραγωγή βιομάζας 9,9% g/L και λιποπεριεκτικότητα 27%. Η παραγωγή σε GLA επηρεάστηκε σημαντικά στα πειράματα που έλαβαν μέρος στον βιοαντιδραστήρα.