Study on the effect of physical, chemical and biotic factors on growth and Ochratoxin A production of black aspergilli isolated from greek vineyards

Abstract

Η μόλυνση των σταφυλιών και των προϊόντων τους μπορεί να προκληθεί από διάφορα είδη μυκήτων πριν το στάδιο της συγκομιδής (προσυλλεκτικά), μετά την συγκομιδή (μετασυλλεκτικά) ή στο στάδιο της μεταποίησης των σταφυλιών. Οι μύκητες που ανήκουν στην ομάδα Aspergillus section Nigri (μαύροι ασπέργιλλοι) έχουν αναφερθεί ως οι κυριότεροι επιμολυντές των σταφυλιών και των προϊόντων τους με Ωχρατοξίνη Α (ΩTA). Η ΩΤΑ είναι ένας δευτερογενής μεταβολίτης των μυκήτων με νεφροτοξικές, ανοσοκατασταλτικές, τερατογόνες και καρκινογόνες ιδιότητες οι οποίες έχουν αρνητικές επιπτώσεις στην υγεία του ανθρώπου και των ζώων. Πιο συγκεκριμένα, ο μύκητας Aspergillus carbonarius έχει αναφερθεί ως ο ισχυρότερος παραγωγός ΩΤΑ μεταξύ των μαύρων ασπέργιλλων. Για το λόγο αυτό, θα πρέπει να λαμβάνεται πολύ σοβαρά υπόψη ο έλεγχος της αλλοίωσης των σταφυλιών από μύκητες, προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η ανάπτυξη ειδών που παράγουν μυκοτοξίνες, ώστε να εξασφαλιστεί η χαμηλότερη δυνατή έκθεση των καταναλωτών σε τέτοιες φυσικές τοξίνες. Αυτή η εργασία επικεντρώθηκε αρχικά στην ανάπτυξη μαθηματικών μοντέλων για την ποσοτικοποίηση της επίδρασης της θερμοκρασίας (15-38 °C), της ενεργότητας ύδατος (0,88-0,98 aw) και της συγκέντρωσης μεταδιθειώδους νατρίου (NaMBS) (0-200 mg L- 1) στην ανάπτυξη του μύκητα Aspergillus carbonarius και στην παραγωγή ΩΤΑ σε μικροβιολογικό θρεπτικό μέσο ανάπτυξης με βάση το χυμό σταφυλιού. Η αύξηση του μύκητα καταγράφηκε σύμφωνα με τη μεταβολή της διαμέτρου του μυκηλίου σε σχέση με το χρόνο. Στη συνέχεια τα δεδομένα προσαρμόστηκαν στο πρωτογενές μοντέλο Baranyi και Roberts για την εκτίμηση των κινητικών παραμέτρων της διάρκειας φάσης προσαρμογής (lag phase) και του ρυθμού αύξησης (growth rate) του μύκητα. Τέλος, οι κινητικές παράμετροι συσχετίστηκαν με τη θερμοκρασία, την ενεργότητα ύδατος και τη συγκέντρωση του μεταδιθειώδους νατρίου μέσω του δευτερογενούς μοντέλου Rosso. Παράλληλα με την αύξηση του μύκητα, μετρήθηκε η παραγόμενη ΩΤΑ, η οποία συσχετίστηκε με τις ανωτέρω παραμέτρους μέσω πολυωνυμικού μοντέλου δευτέρου βαθμού. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, παρατηρήθηκε ότι όσο υψηλότερη ήταν η συγκέντρωση του αντιμυκητιακού παράγοντα NaMBS τόσο μεγαλύτερη ήταν η ανασταλτική επίδρασή του στο ρυθμό αύξησης του μύκητα A. carbonarius. Αντιθέτως, για την παραγωγή ΩΤΑ, στις συνθήκες θερμοκρασίας 20 & 38 °C και βέλτιστης ενεργότητας νερού 0,985 aw παρατηρήθηκε ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις NaMBS διέγειραν την παραγωγή τοξίνης. Η συγκέντρωση της ΩΤΑ αυξήθηκε ακόμη και στις περιπτώσεις όπου η ανάπτυξη του μύκητα μειώθηκε με την προσθήκη NaMBS. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν πειράματα προκειμένου να προσδιοριστεί η επίδραση διαφορετικών ειδών μυκήτων στην παραγωγή ΩΤΑ από τον μύκητα Αspergillus carbonarius. Για τον σκοπό αυτό, σπόρια τριών στελεχών του μύκητα Α. carbonarius που χαρακτηρίστηκαν in vitro από υψηλή παραγωγή τοξίνης και δύο μη ωχρατοξινογόνων μυκήτων της ομάδας Αspergillus section Nigri (Aspergillus tubingensis και Aspergillus japonicus) αναμίχθηκαν σε διαφορετικές αναλογίες (0:100, 25:75, 50:50, 75:25 και 100:0) σε τρυβλία που περιείχαν υπόστρωμα συνθετικού χυμού σταφυλιών. Τα τρυβλία επωάστηκαν σε διαφορετικές θερμοκρασίες (15, 20 και 25 °C), τιμές ενεργότητας ύδατος (0,95 και 0,98 aw) και χρόνο επώασης (7, 14, 21 και 28 ημέρες). Τα αποτελέσματα έδειξαν μεγάλη διακύμανση ως προς την παραγωγή ΩΤΑ από τα τρία ωχρατοξικογόνα στελέχη του μύκητα Α. carbonarius μετά από την συν-καλλιέργεια με τα ανταγωνιστικά μη τοξικογόνα είδη της ομάδας Α. section Nigri, η παρουσία των οποίων είτε ανέστειλε είτε διέγειρε την παραγωγή τοξίνης στα είδη του Α. carbonarius που μελετήθηκαν. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε in vitro η επίδραση της ενεργότητας ύδατος (0,90, 0,94 και 0,98 aw) και της θερμοκρασίας (15, 20 και 25 °C) στην αύξηση και παραγωγή ΩΤΑ τριών στελεχών του μύκητα A. carbonarius με υψηλό δυναμικό παραγωγής τοξίνης, κατά την συγκαλλιέργεια με 11 στελέχη μη ωχρατοξινογόνων μυκήτων που σχετίζονται με τη μυκητοχλωρίδα των σταφυλιών. Παρόλο που αρκετές μελέτες έχουν εξετάσει την οικοφυσιολογία του μύκητα Α. carbonarius σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες, λίγες μόνο μελέτες έχουν διερευνήσει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ του εν λόγω μήκητα και άλλων γενών μυκήτων. Η συγκαλλιέργεια των μυκήτων πραγματοποιήθηκε σε υπόστρωμα συνθετικού χυμού σταφυλιού για χρονικό διάστημα 15 ημερών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στις περισσότερες περιπτώσεις τα στελέχη του μύκητα A. carbonarius επικράτησαν έναντι των υπολοίπων μυκήτων, με εξαίρεση τους μύκητες Penicillium spinulosum και Cladosporium spp. σε θερμοκρασία 15 °C και Botrytis cinerea σε θερμοκρασία 20 °C που παρουσίασαν υψηλότερο ανταγωνισμό κατά τη συγκαλλιέργεια με τα στελέχη του μύκητα Α. carbonarius. Αναφορικά με την παραγωγή ΩΤΑ, η συγκαλλιέργεια με τα ανταγωνιστικά είδη μυκήτων οδήγησε κυρίως σε μείωση ή σπανιότερα σε ελαφρά αύξηση της συγκέντρωσης της τοξίνης, ανάλογα με τη θερμοκρασία και την ενεργότητα ύδατος. Η σημαντικότερη παρατήρηση ήταν ότι το είδος Botrytis cinerea που συμπεριλαμβάνεται στη φυσική μυκητοχλωρίδα των σταφυλιών, μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη και την παραγωγή ΩΤΑ από τα τοξικογόνα στελέχη του μύκητα Α. carbonarius. Εκτός από τα παραπάνω πειράματα, μελετήθηκε επίσης η επίδραση δύο αντιμικροβιακών ενώσεων (ναταμυκίνη και ρητίνη πεύκου) στον ρυθμό αύξησης, τη διάρκεια της φάσης προσαρμογής και την παραγωγή ΩΤΑ από τρία τοξικογόνα στελέχη του μύκητα Α. carbonarius. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η επίδραση της ναταμυκίνης (0-1000 ng mL-1) και της ρητίνης πεύκου (0-2,61%, w/v) σε συνδυασμό με την θερμοκρασία (16,6-33,4 °C) και την ενεργότητα ύδατος (0,90-0,97 aw) με την εφαρμογή πειραματικού σχεδιασμού που βασίστηκε στη μεθοδολογία της επιφανειακής απόκρισης (Response Surface Methodology, RSM) και κεντρικού σύνθετου σχεδιασμού (Central Composite Design, CCD). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ναταμυκίνη ήταν ικανή να επιμηκύνει τη διάρκεια της φάσης προσαρμογής του μύκητα και να μειώσει την παραγωγή ΩΤΑ στις ενδιάμεσες συνθήκες θερμοκρασίας (20 και 25 °C) ενώ η ρητίνη του πεύκου δεν έδειξε να έχει επίδραση στον ρυθμό αύξησης και στην παραγωγή ΩΤΑ του μύκητα στις ίδιες συνθήκες του πειράματος. Τέλος, η ΩΤΑ ανιχνεύθηκε σε χαμηλότερη συγκέντρωση μετά την προσθήκη και των δύο αντιμικροβιακών ενώσεων στις υψηλές θερμοκρασίες (30 °C). Επιπρόσθετα, σε αυτή τη διατριβή μελετήθηκε ο διαχωρισμός και η ταξινόμηση μαύρων ασπέργιλλων, απομονωμένων από σταφύλια ελληνικών αμπελώνων, με τη χρήση φασματοσκοπίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FT-IR). Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στο διαχωρισμό του ωχρατοξικογόνου μύκητα Α. carbonarius από τα άλλα είδη μυκήτων της ομάδας A. niger aggregate (Α. niger και Α. tubingensis). Για το σκοπό αυτό, 182 συνολικά απομονώσεις μυκήτων των ειδών A. carbonarius, A. niger και Α. tubingensis, οι οποίοι προηγουμένως είχαν ταυτοποιηθεί με μοριακές τεχνικές, αναλύθηκαν με φασματοσκοπία FT-IR. Η πρώτη παράγωγος συγκεκριμένων περιοχών κυματαριθμών του φάσματος (3002-2801 cm-1, 1773-1550 cm-1 και 1286-952 cm-1) επιλέχθηκε και υποβλήθηκε σε πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση (Διακριτική Ανάλυση). Τα φάσματα 130 απομονώσεων μυκήτων χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη του μοντέλου και τα υπόλοιπα 52 φάσματα χρησιμοποιήθηκαν για την εξωτερική επικύρωση του μοντέλου. Το ποσοστό των ορθών προβλέψεων κατά την ανάπτυξη του μοντέλου ανήλθε σε 95,3% για τις απομονώσεις του μύκητα Α. carbonarius, ενώ κατά την επικύρωση του μοντέλου το ποσοστό ανήλθε σε 100%. Το συνολικό ποσοστό ορθής ταξινόμησης για τις δύο κλάσεις των μυκήτων (A. carbonarius και A. niger aggregate) ανήλθε σε 97.6% και 100% κατά την ανάπτυξη και επικύρωση του μοντέλου αντίστοιχα. Εν κατακλείδι, τα ευρήματα αυτής της διατριβής συμβάλουν στην καλύτερη κατανόηση της επίδρασης των οικοφυσιολογικών παραγόντων στην παραγωγή ΩΤΑ, καθώς επίσης και στη βελτίωση των στρατηγικών για την ελαχιστοποίηση της εν λόγω μυκοτοξίνης στα σταφύλια και τα παράγωγά τους. Επιπλέον, αυτή η μελέτη μπορεί να θεωρηθεί ως μια πρώτη προσέγγιση για τη διαφοροποίηση και ταξινόμηση διαφορετικών ειδών μυκήτων που ανήκουν στην ομάδα A. section Nigri χρησιμοποιώντας τη φασματοσκοπία FT-IR.

Contamination of grapes and their products may be caused by several fungal species at preharvest, postharvest or grape processing period. Fungal isolates belonging to the Aspergillus section Nigri group have been reported as the main responsible species for Ochratoxin A (OTA) contamination. OTA is a fungal secondary metabolite with nephrotoxic, immunosuppressive, teratogenic, and carcinogenic properties with adverse effects in human and animal health. More specific, Aspergillus carbonarius has been referred as the major ΟΤΑ producer of this group. Fungal spoilage control in grapes must be seriously considered in order to prevent growth of mycotoxin-producing species and ensure the lowest possible consumer exposure in such natural occurring toxins. This thesis has initially focused on the development of a modelling approach in order to quantify the effect of temperature (15-38 °C), water activity (0.88-0.98) and sodium metabisulphite (NaMBS) concentration (0-200 mg L-1) on the Aspergillus carbonarius growth and OTA production of on a Grape Juice based Medium (GJM). According to the results, the effect of NaMBS on the growth and lag phase of A. carbonarius was elucidated. Particularly when higher concentrations of the antifungal compound applied the inhibitory effect on the growth parameters was increased. Contrary, when studying the OTA production, at the temperature conditions of 38 & 20 °C and optimum aw levels of 0.985 aw, treatments with high NaMBS concentrations stimulated the toxin production. OTA content was enhanced even in the cases where fungal growth was delayed by the presence of the antifungal agent. Further on, experiments based on A. carbonarius interspecific interactions with other black Aspergillus species on OTA production were undertaken. Fungal mixed spores were prepared by using three A. carbonarius isolates and two non-OTA producers of A. section Nigri species. These mixtures were grown on a Synthetic Grape Juice Medium (SGM) at different ratios (0:100, 25:75, 50:50, 75:25 and 100:0) and environmental conditions, such as temperature (15, 20 and 25 °C), water activity ranges (0.95 and 0.98), and incubation time (7, 14, 21 and 28 days). A great variation in OTA production of the three ochratoxigenic isolates of A. carbonarius after the co-inoculation with the competing non-toxigenic Aspergillus section Nigri species was noticed. The non-toxigenic species of Aspergillus section Nigri group either inhibited or stimulated the toxin amount released by A. carbonarius. Additionally, experiments in fungal intermingling, as an approach to find new bio-control agents, were conducted. Although several studies have examined the ecophysiology of A. carbonarius at different environmental conditions, only few investigated the interactions between A. carbonarius and other fungal species. This experiment examined the effect of different environmental factors (aw and temperature) and fungal interactions on the growth rates and OTA production, between three A. carbonarius isolates and eleven fungal species commonly isolated by grapes. Results showed that OTA production by A. carbonarius was mainly decreased after co-inoculation with the antagonist species. Few exceptions were observed with some of the competing species, resulting in OTA stimulation by the target fungal species. Nevertheless, the most important observation was that Botrytis cinerea, a common fungal species existed in the mycobiota of grapes, notably reduce growth and OTA production by A. carbonarius. Besides the experiments with biological control agents, the effect of two antimicrobial compounds (natamycin and pine-resin) on the growth rate, lag phase duration and OTA accumulation of three A. carbonarius isolates was also studied. The effect of natamycin (0-1000 ng mL-1) and pine-resin (0-2.61%, w/v) in combination with temperature (16.6-33.4 °C) and water activity (0.90-0.97) was investigated by means of a Response Surface Methodology (RSM). Results showed that natamycin was able to prolong the lag phase duration and decrease OTA production at intermediate temperature conditions (20 and 25 °C) whereas pine-resin had no effect on the growth rate and increased OTA levels at the same conditions assayed. Overall, OTA production was detected at lower levels after treatment with both antifungals at higher temperature conditions (30 °C). Finally, in this study a first effort to distinguish black aspergilli species isolated from grapes of Greek vineyards with the use of FT-IR spectroscopy was attempted. Since characterization of these fungal members is considered as one of the most confusing and difficult tasks, alternative methods such as Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform (DRIFT) Spectroscopy have gained interest lately. A. carbonarius and species of Aspergillus niger aggregate (A. niger and A. tubingensis) showed classification accuracy of 100% in both model calibration and validation. Classification rate for calibration reached 95.3% for A. carbonarius species, whereas for validation the accuracy was 100%. Overall, correct classification for both model calibration and validation, based on molecularly identified black aspergilli species, was 98.3%. In summary, the findings of this thesis may contribute to a better understanding of the effect of ecophysiological factors on OTA production and contamination, as well as on the improvement of strategies for OTA minimization in grapes and their derivatives. Additionally, this study may be considered as a first approach and guide for fungal discrimination and classification of closely-related species belonging to Aspergillus section Nigri group by using the FT-IR spectroscopy.