Γενετική μελέτη, εξελικτικές σχέσεις και δομική ανάλυση απακετυλασών

Abstract

Οι απακετυλάσες πολυσακχαριτών (PDAs) είναι ένζυμα που ανήκουν στις υδατανθρακικές εστεράσες της οικογένειας 4 (CE4) και δρουν σε πολυσακχαρίτες όπως είναι η πεπτιδογλυκάνη, η χιτίνη, η χιτοζάνη, και η ακετυλοξυλάνη. Τα μέλη της CE4 είναι κυρίως μεταλλοεξαρτώμενες υδρολάσες, από ένα ιόν συνήθως Zn2+ ή Co2+. Έχουν μια κοινή καταλυτική δομική ενότητα που ονομάζεται NodΒ και παρουσιάζουν τρισδιάστατη αναδίπλωση τύπου (α/β)6-8 με κοινό στοιχείο της πρωτεϊνικής τους αλληλουχίας τη συντήρηση σχηματισμού της θέσης δέσμευσης από πέντε μοτίβα (ΜΤ1-ΜΤ5). Σε αυτά περιλαμβάνονται τα αμινοξικά κατάλοιπα της τριάδας His–His–Asp τα οποία εμπλέκονται στην δέσμευση του μετάλλου. Ο προτεινόμενος μηχανισμός κατάλυσης θεωρείται τύπου οξέος/βάσης όπου τα καταλυτικά ασπαρτικό οξύ και ιστιδίνη του ενεργού κέντρου έχουν το ρόλο της βάσης και του οξέος, αντίστοιχα. Η πεπτιδογλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος αναγνωρίζεται ως πρωταρχικός στόχος του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος και συνήθως η αποσύνθεσή της οδηγεί σε βακτηριακή λύση. Η απακετυλίωση αποτελεί μια τροποποίηση μέσω της οποίας το βακτήριο διαφεύγει του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή, ο οποίος χρησιμοποιεί μία ποικιλία υδρολυτικών ενζύμων προκειμένου να διασπάσει τη στοιβάδα της πεπτιδογλυκάνης. Οι δομικές πληροφορίες για τη θέση δέσμευσης υποστρωμάτων που εξάγονται από τη μοριακή δομή των απακετυλασών καθώς και συμπλόκων τους με προσδέτες είναι πρωτίστης σημασίας, προκειμένου οι απακετυλάσες να χρησιμοποιηθούν ως μόρια στόχοι φαρμάκων. Τα γονιδιώματα των Bacillus cereus, και Bacillus anthracis, δύο συγγενικών ειδών που ανήκουν στην ομάδα B. cereus, έχουν πολλαπλά γονίδια απακετυλάσης πολυσακχαρίτη. Στην παρούσα διατριβή, προσδιορίστηκαν με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ και παρουσιάζονται οι ακόλουθες πρωτεϊνικές δομές: οι φερόμενες απακετυλάσες πολυσακχαρίτη, Ba0331 (διακριτικότητας 2,59Å) και Βa0330 (διακριτικότητας 1,48Å) από το βακτήριο B. anthracis, το οποίο είναι ο αιτιολογικός παράγοντας της ασθένειας του άνθρακα, καθώς και η απακετυλάση της Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης της πεπτιδογλυκάνης, Bc1974 (διακριτικότητας 1,80Å), του B. cereus. Επίσης προσδιορίστηκαν και παρουσιάζονται οι κρυσταλλικές δομές συμπλόκων της Βc1974 με έξι προσδέτες, διακριτικότητας 1,45 Å, 2,44 Å, 2,45 Å, 2,73 Å, 2,80 Å και 3,05Å οι οποίες αποτελούν τις πρώτες δομές συμπλόκων απακετυλάσης της πεπτιδογλυκάνης με μικρά-μόρια προσδέτες. Οι δομές των πρωτεϊνών Ba0331 και Βa0330 αποτελούνται από δυο ξεχωριστές δομικές ενότητες: μία στην καρβοξυτελική περιοχή που αναδιπλώνει ως μια τυπική υδατανθρακική εστεράση της οικογένειας 4 (CE4), επονομαζόμενη και ως καταλυτική NodΒ ομόλογη δομική ενότητα και μία κοντά στην αμινοτελική περιοχή, που συντίθεται από ένα μοτίβο (4 + 3) β-σάντουιτς, και εμφανίζει δομική ομοιότητα με δομικές ενότητες ινωδονεκτίνης τύπου III (fibronectin type III, Fn3). Οι δύο δομές διατηρούν στο σύνολό τους όμοια αρχιτεκτονική, παρά τις διαφοροποιήσεις α) σε συγκεκριμένες περιοχές της δομικής ενότητας Fn3, β) στις θέσεις δέσμευσης της δομικής τους ενότητας NodΒ όπου και παρουσιάζουν σημαντική διαφορά και γ) στη σχετική διευθέτηση των δύο διακριτών δομικών ενοτήτων, που όμως φανερώνει μια ευελιξία, κοινό χαρακτηριστικό των δύο πρωτεϊνών. Η Ba0331, εμφανίζει διακριτή θέση δέσμευσης, καθώς περιέχει ένα μοναδικό συνδυασμό πολικών και φορτισμένων καταλοίπων στην καταλυτική περιοχή NodB σχηματίζοντας ένα εκτεταμένο δίκτυο αλληλεπιδράσεων. Η παρατήρηση αυτή θέτει περαιτέρω ερωτήματα σχετικά με την απαιτούμενη εξειδίκευση του υποστρώματος, το οποίο ακόμα δεν έχει προσδιοριστεί, τόσο για την Ba0331, όσο και για την ομόλογή της Ba0330. Η δομή της Bc1974 περιλαμβάνει μόνο την τυπική καταλυτική δομική ενότητα NodΒ. Αποκαλύπτονται δύο διακριτές διαμορφώσεις της περιοχής ΜΤ4 της Bc1974, υποδηλώνοντας εγγενή ευελιξία της συγκεκριμένης περιοχής, που μπορεί να παίζει ρόλο στην αναγνώριση του υποστρώματος, στην ικανότητα πρόσδεσής του και τελικά στην ενζυμική δραστικότητα. Η δομική ανάλυση της Bc1974, χρησιμοποιήθηκε για να αποσαφηνιστεί ο ενζυμικός μηχανισμός απακετυλίωσης καθώς και τα προτεινόμενα φαρμακοφόρα χαρακτηριστικά θέτοντας τη βάση μιας προοπτικής ορθολογικού σχεδιασμού, με βάση τη δομή, νέων αντιβακτηριακών παραγόντων. Η ανάπτυξη εξειδικευμένων αναστολέων έναντι της Bc1974 θα έχει πιθανή εφαρμογή και στην ορθόλογή της, απακετυλάση της πεπτιδογλυκάνης του B. anthracis Ba1977, η οποία είναι αποδεδειγμένα βάσει της βιβλιογραφίας λοιμογόνος παράγοντας του άνθρακα. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία του γονιδίου, η αμινοξική αλληλουχία της πρωτεΐνης και η τρισδιάστατη δομή της, καθώς και η βιολογική της λειτουργία είναι εγγενώς συνδεδεμένα μέσω της εξέλιξης και της γενετικής των πληθυσμών. Τα τελευταία χρόνια μελέτες έχουν περιγράψει τη λειτουργική διαφοροποίηση των γονιδίων και τη σημασία της στην εξέλιξη μέσω της σημαντικής διαδικασίας της διπλοποίησης γονιδίου. Για τον καθορισμό φυλογενετικών σχέσεων στις οικογένειες γονιδίων απακετυλάσης πολυσακχαρίτη του Β. anthracis Ames (12 ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης στο γονιδίωμά του) και του B. cereus ATCC14579 (11 ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης στο γονιδίωμά του) χρησιμοποιήθηκαν οι αμινοξικές και οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες που απαρτίζουν χωριστά τις δομικές ενοτήτες των PDAs. Η απεικόνιση των εξελικτικών γεγονότων στις δύο οικογένειες συνδυάστηκε και με την ανάλυση γονίδιων των PDAs από άλλα στελέχη του γένους Bacillus προκειμένου να ερευνηθούν εξελικτικές σχέσεις των γονιδίων PDAs. Διαδοχικά γεγονότα διπλοποίησης έχουν οδηγήσει σε ομάδες γονιδίων (ή υποοικογένειες) που εμφανίζουν μεταξύ τους μεγαλύτερη ομολογία σε σύγκριση με οποιοδήποτε άλλο γονίδιο εντός της κάθε οικογένειας. Έγινε ανίχνευση της διάδοσης της δομικής ενότητας Fn3 μέσω της φυλογενετικής ανάλυσης, ενώ η δομική μελέτη οδήγησε σε επιπρόσθετες υποθέσεις για το ρόλο της, οι οποίες συνοψίζονται στα ακόλουθα: είτε στο να προσδώσει ιδιότητες προσκόλλησης/αλληλεπίδρασης βάση συγκεκριμένων διαφορών στην δομή των δύο πρωτεϊνών και σε συνδυασμό με το ιστορικό αυτής της δομικής ενότητας, είτε για να επεκτείνει την κοιλότητα δέσμευσης, ή/και για να εισάγει ευελιξία. Αναλύθηκαν τα δύο παράλογα γονίδια bα0330 και ba0331 του Β. anthracis μέσω συγκεκριμένων διαφορών στην αλληλουχία των γονιδίων, στην αλληλουχία των πρωτεϊνών, στην δομή των πρωτεϊνών, καθώς και μέσω της διάταξής τους στο γονιδίωμα, της ανίχνευσης της δράσης της επιλογής στην εξέλιξη της γονιδιακής διπλοποίησης, και του κυτταρικού εντοπισμού των αντίστοιχων πρωτεϊνών τους, (από τα διαθέσιμα πειράματα εντοπισμού στη βιβλιογραφία). Οι τρισδιάστατες δομές απακετυλασών της οικογένειας των γονιδίων απακετυλάσης πολυσακχαρίτη χρησιμοποιήθηκαν για την εξελικτική μελέτη της θέσης δέσμευσης μετά από γεγονότα διπλοποίησης. Μέσα από την εργασία αυτή υπογραμμίζεται η σημασία της επίστασης στην εξέλιξη των πρωτεϊνών. Η δομική συγκριτική ανάλυση συνολικά επτά (τεσσάρων υπαρχουσών στη βιβλιογραφία και τριών από την παρούσα εργασία) προσδιορισμένων PDAs των B. anthracis και B. cereus υποστηρίζει τα συμπεράσματα της ανάλυσης αλληλουχίας και καταδεικνύει την ύπαρξη δομικών τροποποιήσεων στον σχηματισμό της θέσης δέσμευσης, παρά την υψηλή συντήρηση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας της και του επίπεδου αναδίπλωσής της. Αυτό μπορεί να υποδεικνύει ότι τα τμήματα της αλληλουχίας που σχηματίζουν τη θέση δέσμευσης βρίσκονται υπό εξελικτική πίεση για να φιλοξενήσουν και να αναγνωρίσουν διακριτά κατάλοιπα πολυσακχαριτών ανάλογα με την κυτταρική θέση, τη χρήση ή το περιβάλλον. Αν και η πρωτεϊνική δομή είναι πιο συντηρημένη από την αμινοξική ακολουθία, αυτή η μελέτη έδειξε ότι μικρές δομικές τροποποιήσεις στα πολλαπλά μοτίβα που συνθέτουν τη θέση δέσμευσης μπορεί να προκαλέσουν λειτουργική διαφοροποίηση. Η εξελικτική λειτουργική διαφοροποίηση, και η ανάπτυξη της εξειδίκευσης της καταλυτικής δομικής ενότητας NodB με την έννοια των μικρών προσαρμογών της θέσης πρόσδεσης σε διαφορετικά αλλά ουσιαστικά παρόμοια υποστρώματα προφανώς είναι το αποτέλεσμα γεγονότων γονιδιακής διπλοποίησης. Εν κατακλείδι, η σύγκριση των κοιλοτήτων δέσμευσης του υποστρώματος μεταξύ των διαφόρων φερόμενων απακετυλασών πολυσακχαρίτη του Β. anthracis και του B. cereus αποκάλυψε αξιοσημείωτη ποικιλότητα ως προς το μέγεθος και το σχήμα της κοιλότητας, καθώς επίσης και ως προς τον τύπο των αμινοξέων που τις συνθέτουν, εντοπίζοντας στοιχεία απόκλισης στα λειτουργικά χαρακτηριστικά με ταυτόχρονη διατήρηση των διακριτών τοπικών δομικών χαρακτηριστικών στην οικογένεια των PDAs. Παρότι απόψεις της λειτουργικής απόκλισης των απακετυλασών έχουν επισημανθεί σε αυτή τη διατριβή, η άμεση συσχέτιση των στην εξειδίκευση του υποστρώματος παραμένει ένα σημαντικό ερώτημα που μένει να απαντηθεί, ενώ και ο ρόλος των υπολοίπων φερόμενων απακετυλασών μένει να διελευκανθεί.

Polysaccharide deacetylases (PDAs), are members of the carbohydrate esterase family 4 (CE4), acting on polysaccharides, such as chitin and chitosans, peptidoglycans, acetylxylans, and β-1,6-GlcNAc polysaccharides. The CE4 family members share a conserved catalytic core termed the NodB homology domain which adopts an (α/β)6-8 three-dimensional fold, and they are mainly metal depended hydrolases, with Zn2+ and Co2+ as the most common metal cations. Common feature of their catalytic core is the conservation of five active site motifs in their protein sequence that include the His–His–Asp metal binding triad. The proposed catalytic mechanism is a type acid/base catalysis with the catalytic Asp and His residues as general base and general acid, respectively. The cell wall peptidoglycan is recognized as a primary target of the innate immune system and usually its disintegration results in bacterial lysis. The N-deacetylation is an enzyme activated secondary modification of bacterial glycan, correlating with the bacterium resistance of the host lysozyme, and the effects on pathogen recognition via different host receptors. , by introducing additional positive charge into the cell wall that may increase the resistance of the bacterium to cationic antimicrobial peptides. The structural information of the substrate binding site of deacetylases and their complexes with ligands is of prime importance for deacetylases to be used as drug target molecules. Genomes of Bacillus anthracis and its relative Bacillus cereus, both belonging to the B. cereus group of species, contain multigenes of PDAs. In the present thesis, the 3D structures of the putative polysaccharide deacetylases Ba0331 (at 2.59Å resolution) and Ba0330 (at 1.48Å) from the B. anthracis bacterium, the causative agent of the anthrax disease, are presented. In addition the N- acetylglucosamine peptidoglycan deacetylase, Bc1974 (at 1.80Å) from B. cereus bacterium is presented. The structure of six Βc1974 complexes with distinct ligands have also been determined and presented at resolution of 1.45 Å, 2.44 Å, 2.45 Å, 2.73 Å, 2.80 Å and 3.05Å, which to the best of our knowledge, are the first crystal structures of a peptidoglycan GlcNAc deacetylase in complex with small-molecule ligands. The structures of the Ba0331 and Ba0330 proteins revealed two distinct structural domains, a C-terminal domain with the typical fold of carbohydrate esterase family 4 (NodB catalytic domain) and an N-terminal domain composed of a two-layered (4 + 3) β-sandwich, with structural similarity to the fibronectin type III (Fn3) domain. The two structures retain asimilar architecture in general, despite the variations a) in specific regions of the Fn3 domain, b) in the binding sites of their NodB domains where they present a significant difference, and c) in the relative position of the two distinct domains, which reveals an interdomain structural flexibility that is a common feature of the two proteins. Ba0331, among the CE4 enzymes, exhibits a distinct binding site, as it contains a unique combination of polar and charged residues in the NodB catalytic domain, forming an extensive network of interactions. The structure of Bc1974 retains the overall shape of the typical fold of the catalytic NodΒ domain. The structures of the protein-ligand complexes revealed two distinct conformations of the catalytic loop, known as motif 4, which suggests an intrinsic flexibility of this region that may play a role in the substrate recognition, binding and ultimately in enzymatic activity of Bc1974. Structural analysis was used to elucidate the enzyme deacetylation mechanism as well as to the pharmacophoric assertion, setting the basis of a rational structure based drug design of novel antibacterial agents. The development of specific inhibitors against Bc1974 will also be likely to be applied in its orthologous deacetylase of peptidoglycan of B. anthracis Ba1977, which is required for full virulence of B. anthracis as demonstrated in the literature. The PDA gene nucleotide sequence, the amino acid sequence of the protein and its three-dimensional structure, as well as its biological function are inherently linked through evolution and population genetics. Recent studies have described the functional differentiation of genes and its significance in evolution through the important process of gene duplication. Phylogenetic relationships in the polysaccharide deacetylase gene families of B. anthracis Ames (12 paralogous) and B. cereus ATCC14579 (11 paralogous) were investigated. Separate phylogenetic studies for the two distinct domains of the PDAs were performed for both amino acid and nucleotide sequences. In order to construct a composite phylogenetic tree these data have also been combined with the analysis of PDA genes from other strains of the genus Bacillus. The spread of the Fn3 domain acquisition was traced by phylogenetic analysis.Also through the structural study additional assumptions about its role were proposed: a) to confer adhesion or recognition properties, based on specific differences in the domain structure between the two protein paralogues and based on the long history of this domain, b) to introduce length or/and c) to introduce mobility. The two paralogous genes of B. anthracis bα0330 and ba0331 were analyzed via specific differences in the gene sequence, protein sequence, and 3D structure of the proteinmolecules, as well as by their sequence arrangement in the genome, detection of selection in the evolution of gene duplication, and localization patterns available in the literature. The three-dimensional structures of the deacetylases of the two polysaccharide deacetylase genes familes were used for the evolutionary study of the binding site after gene duplication events. The structural comparative analysis of a total of seven (four existing in the literature and three of the present work) structurally determined PDAs of B. anthracis and B. cereus, supports the conclusions of the sequence analysis and demonstrates that, despite the high conservation on the protein sequence, there are distinct differences in the binding site formation, the folding level and the active site assembly. This may indicate that, the binding site forming sequence fragments are under functionally-driven evolutionary pressure in order to accommodate and recognize distinct polysaccharide residues according to cell location, use or environment. This is probably an indication of the distinct roles of PDAs at a cellular level, however it is still an open subject of biochemical verification. Although protein structure is more conserved than the sequence, this study showed that small structural modifications in a multi motif assembled binding domain may cause functional diversification. Evolutionary functional diversification, as in the development of substrate specificity in the PDA NodB binding domain, in the form of small adaptations, apparently has occurred through gene duplication events. And the essential role of epistasis appears in protein evolution. Overall, the comparison of the binding cavities among the putative polysaccharide deacetylases of B. anthracis and B. cereus revealed remarkable variation in cavity size and shape, as well as in the amino acid composition of the cavities, indicating elements of divergence in functional characteristics with concurrent conservation of distinct local structural features in the PDA family. Although aspects of the functional diversity have been highlighted in this thesis, direct correlation with substrate specificity of deacetylases remains an important question to be answered, while the role of the rest putative deacetylases remains to be elucidated.