Επίδραση της επιγενετικής κληρονομικότητας στη βιολογική αντιμετώπιση του μύκητα Verticillium dahliae

Abstract

Επιγενετικές τροποποιήσεις που προκαλούνται από βιοτικές ή αβιοτικές καταπονήσεις δύνανται να επηρεάσουν σημαντικά την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την άμυνα των φυτών εναντίον παθογόνων μικροοργανισμών. Η επιγενετική κληρονομικότητα αναφέρεται στη διατήρηση ορισμένων εξ’ αυτών των τροποποιήσεων στην επόμενη γενεά. Το αντικείμενο της συγκεκριμένης διατριβής είναι η μελέτη του μηχανισμού μέσω του οποίου ένα ωφέλιμο για τα φυτά βακτήριο το Paenibacillus alvei K165 προσδίδει κληρονομούμενη ανθεκτικότητα εναντίον του φυτοπαθογόνου μύκητα Verticillium dahliae, μέσω της εφαρμογής του σε μητρικά φυτά Arabidopsis thaliana, το οποίο επιβεβαιώθηκε και με ενδοφυτική ποσοτικοποίηση του μύκητα. Πραγματοποιήθηκαν μεταγραφωμικές και μεταβολομικές αναλύσεις στο υπέργειο μέρος φυτών στα οποία εφαρμόστηκε το στέλεχος Κ165 καθώς και των απογόνων τους ώστε να μελετηθεί η ανθεκτικότητά τους εναντίον του μύκητα Verticillium dahliae. Τα αποτελέσματα της μεταγραφωμικής ανάλυσης κατέδειξαν έναν σημαντικό αριθμό γονιδίων με ρόλο στο μονοπάτι βιοσύνθεσης φαινυλοπροπανοειδών των οποίων η έκφραση επηρεάζεται σημαντικά τόσο στα ίδια τα φυτά που εφαρμόστηκε το στέλεχος Κ165 όσο και στους απογόνους τους. Επίσης φαίνεται πως τόσο το μονοπάτι του σαλικυλικού οξέος όσο και αυτό του ιασμονικού/αιθυλενίου ενεργοποιούνται μέσω της εφαρμογής του στελέχους Κ165. Οι μεταβολομικές αναλύσεις έδειξαν σαφή διαφοροποίηση των μεταβολομικών προφίλ των εφαρμογών που ελέχθησαν καθώς και αύξηση του μεταβολισμού των λιπιδίων στα φυτά που δέχθηκαν την εφαρμογή του στελέχους Κ165 και στους απόγονους τους. Για επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων της μεταγραφομικής ανάλυσης πραγματοποιήθηκε μελέτη της έκφρασης ενός σημαντικού αριθμού γονιδίων των οποίων η έκφραση φάνηκε ότι επηρεάζεται τόσο στα ίδια τα φυτά που εφαρμόστηκε το στέλεχος Κ165 όσο και στους απογόνους τους. Τα γονίδια που μελετήθηκαν έχουν βασικό ρόλο στην άμυνα των φυτών και συμμετέχουν στα μονοπάτια του σαλικυλικού οξέος, του ιασμονικού/αιθυλενίου και της βιοσύνθεσης φαινυλοπροπανοειδών. Ωστόσο η μελέτη της έκφρασης των γονιδίων PR1, PR5, NPR1 και PDF1.2 έδειξε πως ενώ τις πρώτες ημέρες από την εφαρμογή του μύκητα υπάρχει ενεργοποίηση και του μονοπατιού του σαλικυλικού οξέος, αργότερα την σκυτάλη φαίνεται να αναλαμβάνει το μονοπάτι ιασμονικού/αιθυλενίου καθώς παρατηρείται σημαντική υπερέκφραση του γονιδίου PDF1.2 στα φυτά που εφαρμόστηκε το βακτήριο. Ωστόσο στους ανθεκτικούς απογόνους παρατηρείται παράλληλη ενεργοποίηση των δύο μονοπατιών. Όσον αφορά στο μονοπάτι βιοσύνθεσης φαινυλοπροπανοειδών φαίνεται πως πράγματι, ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων επηρεάζεται σημαντικά στα φυτά που εφαρμόστηκε το στελέχος Κ165 και στους απογόνους αυτών. Ωστόσο, το γονίδιο CAD8 ξεχωρίζει μέσω της σημαντικής υπερέκφρασής του στους ανθεκτικούς απογόνους και το γονίδιο 4CL2 μέσω της μεγάλης υπερέκφρασής του στα φυτά που εφαρμόστηκε το στέλεχος Κ165 ενώ το γονίδιο CCR2 παρουσιάζει μεγάλη υπερέκφραση στους ανθεκτικούς απογόνους και ακόμα μεγαλύτερη στα ίδια τα φυτά στα οποία εφαρμόζεται το βακτήριο. Αντιθέτως ο μύκητας φαίνεται πως μειώνει την έκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου. Μετρήθηκε επίσης η συγκέντρωση της λιγνίνης στο υπέργειο μέρος των φυτών με τη χρήση φασματοφωτομετρίας, καθώς πρόκειται για το τελικό προϊόν που παράγεται από την ενεργοποίηση του μονοπατιού βιοσύνθεσης φαινυλοπροπανοειδών στα φυτά. Οι μετρήσεις επιβεβαίωσαν την αυξημένη συσσώρευση λιγνίνης στα φυτά που δέχθηκαν την εφαρμογή του στελέχους Κ165 αλλά και στους απογόνους αυτών. Με τη πραγματοποίηση πειραμάτων παθογένειας σε μεταλλαγμένες σειρές Arabidopsis thaliana μελετήθηκε ο ρόλος των γονιδίων CAD1, CAD6, CAD8 των οποίων η έκφραση φαίνεται να επηρεάζεται σημαντικά στους ανθεκτικούς απογόνους. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων παθογένειας επιβεβαίωσαν τον ρόλο των παραπάνω γονιδίων στη πρόκληση του φαινομένου καθώς το στέλεχος Κ165 απέτυχε να προστατέψει τα μεταλλαγμένα φυτά και τους απογόνους τους από τον μύκητα V. dahliae. Η ενδοφυτική ποσοτικοποίηση του μύκητα επίσης έδειξε ότι δεν υπάρχει μείωση της συγκέντρωσης του μύκητα στα φυτά που δέχθηκαν το στέλεχος Κ165 ή στους απογόνους αυτών. Πραγματοποιήθηκαν ακόμα πειράματα ανοσοκατακρίμνησης χρωματίνης και ανοσοαπoτυπώματος κατά western με σκοπό να επιβεβαιωθεί η επιγενετική φύση του φαινομένου μέσω του εντοπισμού κληρονομούμενων επιγενετικών τροποποιήσεων που προκαλεί το στέλεχος Κ165. Τα επίπεδα ακετυλίωσης συνολικά στο γονιδίωμα των ανθεκτικών απογόνων βρέθηκαν αυξημένα σε σχέση με τον μάρτυρα. Χρησιμοποιήθηκαν εξειδικευμένα αντισώματα για τον εντοπισμό ακετυλιώσεων στην ιστόνη 3 και μελετήθηκαν τα επίπεδα ακετυλίωσης των γονιδίων PR1, PR5, PDF1.2, CAD4 και CAD8 στις περιοχές των υποκινητών και στο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης με τη χρήση της μεθόδου Real time PCR. Τα επίπεδα ακετυλίωσης στους υποκινητές των γονιδίων PR1, PDF1.2, CAD4 και CAD8 των ανθεκτικών απογόνων βρέθηκαν ιδιαίτερα αυξημένα σε σχέση με τους μάρτυρες. Τέλος, μελετήθηκε ο ρόλος των γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την ακετυλίωση των αμινοξέων της ιστόνης 3 στην πρόκληση της επιγενετικά κληρονομούμενης ανθεκτικότητας μέσω πραγματοποίησης πειραμάτων παθογένειας σε μεταλλαγμένες σειρές Arabidopsis thaliana. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τον ρόλο των HAC και HAG ακετυλοτρανσφερασών στη πρόκληση της κληρονομούμενης ανθεκτικότητας από το στέλεχος Κ165 καθώς αυτό απέτυχε να μειώσει τα συμπτώματα που προκαλεί ο μύκητας στα μεταλλαγμένα φυτά που εφαρμόστηκε το βακτήριο και τους απογόνους αυτών. Η ενδοφυτική ποσοτικοποίηση του μύκητα επίσης έδειξε ότι δεν υπάρχει μείωση της συγκέντρωσης του μύκητα στα φυτά που δέχθηκαν το στέλεχος Κ165 ή στους απογόνους αυτών.

Epigenetic modification caused by biotic or abiotic stress can severely affect the expression of genes related to plant’s defense responses. Epigenetic inheritance is the transfer of those modifications to the next generation via the germline. The aim of this study is to unravel the mechanism of the epigenetically inherited resistance against Vericillium dahliae that the biocontrol agent Paenibacillus alvei K165 confers to the offspring of Arabidopsis thaliana treated plants. The phenomenon was confirmed with endophytic quantification using Real time PCR. Metabolomic and transcriptomic analyses were performed in the above ground part of the plants treated with K165 and their offspring to study their response against the fungus Verticillium dahliae. The results of the transcriptomic analysis revealed a significant number of genes in the phenylpronanoid biosynthesis pathway that are affected by K165 in the plants treated with it as well as in their offspring. Also it seems that both the salicylic acid and the jasmonic acid/ethylene pathways are upregulated by K165. According to the results of the metabolomic analysis there is significant differentiation of the metabolic profiles of plants from all the treatments. The lipid metabolism also seems to be up-regulated in plants treated with K165 and their offspring. To confirm the transcriptomic analysis results the expression levels of a set of genes that are affected by K165 and in the resistant offspring were studied using Real time PCR. The selected genes have a basic role in plant defense, participating in the salicylic acid pathway, the jasmonic acid pathway and the phenylpropanoid biosynthesis pathway. It was revealed that although at 3 days post inoculation with Verticillium, salicylic acid pathway is up-regulated, later at 7 days it is the jasmonic acid/ethylene pathway that takes over since the expression of PDF1.2 is significantly elevated in the Κ165-treated plants. On the other hand in the resistant offspring upon infection with the fungus both pathways are induced at the same time. As far as the phenylpropanoid biosynthesis pathway is concerned it seems that an important number of genes is affected both in K165 treated plants and in their offspring but they are also affected by Verticillium. However the expression of CAD8 is significantly increased in the resistant offspring. Lignin concentration was measured using a UV spectrophotometer since it is the final product of phenylpropanoid biosynthesis pathway in plants. Indeed it was found significantly higher in K165 treated plants and in their offspring. Pathogenicity experiments were performed using Arabidopsis thaliana mutants to study the role of CAD1, CAD6 and CAD 8 genes in the observed phenomenon since they seem to be significantly affected in K165 treated plants and their offspring. The results confirmed the role of these genes in the inherited resistance caused by K165 since the bacterium failed to protect the mutants and their offspring. Immunoprecipitation experiments using specific antibodies against H3 acetylation and western blot analysis were performed in order to confirm the epigenetic nature of the described phenomenon by detecting inheritable epigenetic modifications caused by K165. The whole genome acetylation levels in the resistant offspring were found significantly increased. The acetylation levels of PR1, PR5, PDF1.2, CAD4 and CAD8 genes in the promoter and open reading frame areas were studied using Real time PCR. The results showed increased acetylation levels in the promoters of PR1, PDF1.2, CAD4 and CAD8 in the resistant offspring. Finaly the role of HAC and HAG acetyltransferase genes in the observed epigenetically inherited resistance was studied with pathogenicity experiments in Arabidopsis mutants. Once again the bacterium failed to protect the mutants and their offspring. Therefore the role of those genes in the inherited resistance caused by K165 was confirmed. The results suggest that the phenomenon is controlled epigenetically.