In vitro probiotic attributes of lactic acid bacteria and their spoilage potential in meat products

Abstract

Τη σημερινή εποχή το καταναλωτικό ενδιαφέρον και οι τάσεις στην αγορά των τροφίμων έχουν μεταβληθεί σημαντικά. Τρόφιμα που μπορεί να είναι ωφέλιμα για την υγεία και βοηθούν στην ευζωία εμφανίζουν αυξημένη ζήτηση και για το λόγο αυτό οι βιομηχανίες τροφίμων καθώς και η έρευνα επικεντρώνονται προς αυτή την κατεύθυνση. Μεγάλη μερίδα της αγοράς των λειτουργικών προϊόντων, κατέχουν τα προβιοτικά προϊόντα και ο συγκεκριμένος τομέας φαίνεται να επεκτείνεται. Τα γαλακτοκομικά προϊόντα έχουν εκτενώς μελετηθεί ως πηγές προβιοτικών καλλιεργειών και ως προϊόντα-φορείς των προβιοτικών, όμως άλλες πηγές πέρα των γαλακτοκομικών, θεωρούνται πολύ σημαντικές έτσι ώστε να αυξηθούν οι κατηγορίες των τροφίμων στις οποίες τα προβιοτικά είναι διαθέσιμα σε όλους τους καταναλωτές. Στο πλαίσιο αυτό, η παρούσα μελέτη εστιάζει στο: α) να μελετηθεί το προβιοτικό δυναμικό οξυγαλακτικών βακτηρίων που έχουν απομονωθεί από παραδοσιακά ζυμούμενα ελληνικά προϊόντα, β) να χρησιμοποιηθούν επιλεγμένα οξυγαλακτικά βακτήρια σαν εκκινητήριες συγκαλλιέργειες ή πρόσθετες καλλιέργειες σε ζυμούμενα προϊόντα κρέατος, γ) να ερευνηθεί η δυνατότητα χρήσης εναλλακτικών μεθόδων όπως αυτή των εδώδιμων μεμβρανών, για τη μεταφορά των προβιοτικών καλλιεργειών σε προϊόντα κρέατος θερμικής επεξεργασίας και δ) να αξιολογηθεί η τεχνική της φασματοσκοπίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier σαν εργαλείο για την πρόβλεψη της ποιότητας των ανωτέρω προϊόντων κρέατος. Σε πρώτο στάδιο οξυγαλακτικά βακτήρια, απομονωμένα απο παραδοσιακά ζυμούμενα ελληνικά γαλακτοκομικά και ζωϊκά προϊόντα, ταυτοποιήθηκαν μοριακά και μελετήθηκε το προβιοτικό τους δυναμικό in vitro. Δεκαεννέα (19) απο τα 47 στελέχη οξυγαλακτικών επιλέχθηκαν ως τα καλύτερα με τη βοήθεια μιας σειράς δοκιμών. Επιπρόσθετα, άλλα στελέχη οξυγαλακτικών, που απομονώθηκαν από ελιές, μελετήθηκαν επίσης ως προς τα προβιοτικά τους χαρακτηριστικά, με 17 απο αυτά να εμφανίζουν τις καλύτερες ιδιότητες. Τα ίδια στελέχη μελετήθηκαν στη συνέχεια ως προς την ικανότητα παραγωγής γ-αμινοβουτυρικού οξέος καθώς και αυτεπαγωγέων-2 (μορίων-σημάτων επικοινωνίας), οπού κανένα απο τα στελέχη δεν εμφανίστηκε θετικό ως προς την παραγωγή των συγκεκριμένων μορίων. Τέσσερα (4) απο αυτά τα στελέχη εξετάστηκαν περαιτέρω για την ικανότητα τους να παράγουν αυτεπαγωγείς-2, υπό συνθήκες καταπόνησης, παρόμοιες με αυτές που απαντώνται σε ζυμούμενα τρόφιμα και στο πεπτικό σύστημα του ανθρώπου. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε μελέτη της έκφρασης του γονιδίου luxS (υπεύθυνου για την παραγωγή αυτεπαγωγέων τύπου-2) υπο αυτές τις συνθήκες καταπόνησης με τη χρήση PCR σε πραγματικό χρόνο. Παρατηρήθηκε σημαντική διακύμανση στα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου μεταξύ των διαφορετικών συνθηκών καταπονήσεων και μεταξύ των διαφορετικών στελεχών, αν και γενικά τα επίπεδα θεωρήθηκαν χαμηλά. Σε δεύτερο στάδιο, επιλεγμένα στελέχη οξυγαλακτικών που εμφάνισαν προβιοτικό δυναμικό χρησιμοποιήθηκαν σαν πρόσθετες καλλιέργειες για την παραγωγή ζυμούμενων αλλαντικών (σαλάμι αέρος). Μικροβιολογικές, φυσικοχημικές (pH και aw) και οργανοληπτικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της ζύμωσης, ωρίμανσης και συντήρησης των σαλαμιών στους 4 και 12 °C. Η παρουσία του προβιοτικού στελέχους μέχρι και το τέλος της διάρκειας ζωής του προϊόντος επιβεβαιώθηκε με την τεχνική της ηλεκτροφόρησης αγαρόζης σε εναλασσόμενο πεδίο. Τα αποτελέσματα ήταν πολύ ικανοποιητικά, αφού τo προβιοτικό στέλεχος διατηρήθηκε σε υψηλά επίπεδα (>6 log CFU/g), η καλλιέργεια φάνηκε να προσδίδει τα επιθυμητά τεχνολογικά χαρακτηριστικά και τα νέα προϊόντα είχαν αποδεκτά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Σε επόμενο στάδιο ερευνήθηκε η αποτελεσματικότητα της εφαρμογής των εδώδιμων μεμβρανών αλγινικού νατρίου ως φορείς των προβιοτικών καλλιεργειών σε συνδυασμό με την τεχνική της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης (ΥΥΠ) σε φέτες ζαμπόν. Τα προβιοτικά οξυγαλακτικά βακτήρια ενσωματώθηκαν στο διάλυμα αλγινικού νατρίου. Οι φέτες ζαμπόν (με ή χωρίς προηγούμενη μεταχείριση με ΥΥΠ:500MPa για 2 min) συσκευάστηκαν σε κενό, σε επαφή με τις εδώδιμες μεμβράνες και στη συνέχεια συντηρήθηκαν στους 4, 8 και 12 °C, για 66, 47 και 40 ημέρες αντίστοιχα. Πραγματοποιήθηκαν μικροβιολογικές και φυσικοχημικές (pH, aw) αναλύσεις καθώς επίσης και μέτρηση του χρώματος. Επιπλέον πραγματοποιήθηκε οργανοληπτική αξιολόγηση, ενώ η παρουσία και το ποσοστό επιβίωσης του κάθε προβιοτικού στελέχους κατά τη συντήρηση επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης σε εναλασσόμενο πεδίο. Σε φέτες ζαμπόν χωρίς τη μεταχείριση με ΥΥΠ, τα επίπεδα των προβιοτικών βακτηρίων ήταν της ταξης των 6 log CFU/g κατά τη συντήρηση σε όλες τις θερμοκρασίες. Παρόμοια αποτελέσματα έδωσαν οι φέτες ζαμπόν που υποβλήθηκαν σε μεταχείριση με ΥΥΠ, αλλά με διαφορετικές τιμές pH μεταξύ των δυο περιπτώσεων. Τα ζαμπόν στα οποία είχαν προστεθεί προβιοτικές καλλιέργειες παρουσίασαν μια πιο όξινη γεύση και άρωμα σε σύγκριση με το μάρτυρα, παρόλο που αυτά τα χαρακτηριστικά μειώθηκαν αρκετά στην περίπτωση του ζαμπόν με ΥΥΠ. Γενικά τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν ενθαρρυντικά, αφού τα προβιοτικά βακτήρια κατάφεραν να περάσουν επιτυχώς απο την εδώδιμη μεμβράνη στο ζαμπόν, ανεξάρτητα απο τη μεταχείριση με ΥΥΠ. Συγχρόνως, παρόμοια μελέτη πραγματοποιήθηκε εστιάζοντας στην αντιμικροβιακή δράση των εδώδιμων μεμβρανών αλγινικού νατρίου εμπλουτισμένων με αιθέριο έλαιο ρίγανης, ενάντια στο παθογόνο Listeria monocytogenes κατά την παρουσία του στο ίδιο προϊόν με ή χωρίς μεταχείριση με ΥΥΠ. Πραγματοποιήθηκαν οι ίδιες αναλύσεις με αυτές που αναφέρθηκαν στην προηγούμενη μελέτη, ενω η απουσία/παρουσία και το ποσοστό επιβίωσης του κάθε στελέχους Listeria monocytogenes κατά τη διάρκεια της συντήρησης πραγματοποιήθηκε με την ηλεκτροφόρηση αγαρόζης σε εναλασσόμενο πεδίο. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα η ΥΥΠ είχε επίδραση στη Listeria, ανεξάρτητα απο τη θερμοκρασία συντήρησης. Η προσθήκη αιθερίου ελαίου ρίγανης στις εδώδιμες μεμβράνες προκάλεσε μείωση ~1.5 log στον πληθυσμό της Listeria στους 8 και 12 °C, στο τέλος της συντήρησης και περίπου 2.5 log μείωση στους 4 °C. Ο συνδυασμός ΥΥΠ και εδώδιμων μεμβρανών εμπλουτισμένων με αιθέριο έλαιο ρίγανης στο ζαμπόν θεωρήθηκε η πιο αποτελεσματική μεταχείριση προκαλώντας σημαντική μείωση ή ακόμη και απουσία του παθογόνου, επηρεάζοντας ταυτόχρονα τους υπόλοιπους βακτηριακούς πληθυσμούς. Σε τελικό στάδιο, αξιολογήθηκε το δυναμικό της φασματοσκοπίας Υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FTIR) σαν εργαλείο για τον προσδιορισμό των ποιοτικών χαρακτηριστικών των προϊόντων κρέατος εμπλουτισμένων με προβιοτικές καλλιέργειες. Τα προϊόντα που μελετήθηκαν ήταν αυτά που προέκυψαν από τις προηγούμενες μελέτες όπως τα ζυμούμενα αλλαντικά, οι φέτες ζαμπόν (χωρίς περαιτέρω μεταχείριση-μάρτυρας), οι φέτες ζαμπόν με εδώδιμες μεμβράνες προβιοτικών και εδώδιμες μεμβράνες με αιθέριο έλαιο ρίγανης, με ή χωρίς μεταχείριση με ΥΥΠ. Μοντέλα Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων (PLS) αναπτύχθηκαν με στόχο τη συσχέτιση των φασματικών δεδομένων απο την ανάλυση με FTIR με την αλλοίωση κατά τη συντήρηση στις διάφορες θερμοκρασίες ανάλογα με το εξεταζόμενο προϊόν. Ο σκοπός της μοντελοποίησης ήταν ο διαχωρισμός των δειγμάτων με βάση την αντίστοιχη ποιοτική τους κατηγορία, καθώς επίσης και να προβλεφθεί ο μικροβιακός πληθυσμός απευθείας από τα φασματικά δεδομένα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επεξεργασία των προϊόντων επηρέασε την ακρίβεια της κατηγοριοποίησης των δειγμάτων σε ποιοτικές κλάσεις. Η αξιολόγηση της ακρίβειας των μοντέλων PLS ως προς τον υπολογισμό των μικροβιακών πληθυσμών βασίστηκε σε γραφήματα και στατιστικούς δείκτες (Βf, Af, RMSE, % PE). Τα δεδομένα που καταγράφηκαν για πρώτη φορά έδειξαν ότι ενω η τεχνική της φασματοσκοπίας υπερύθρου έχει τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθεί για την ταχεία αξιολόγηση των προϊόντων, πρόσθετες επεξεργασίες όπως η ζύμωση, τα πρόσθετα και η ΥΥΠ, μπορούν να επηρεάσουν την αποτελεσματικότητα της τεχνικής.

Nowadays, consumer’s interest and trends on buying food products have changed drastically. Food products that can be beneficial for human health and support wellbeing, are particularly on demand and a lot of attention is being paid from both industry and research. A big portion of the functional food market, belongs to probiotic food products and this sector will be expanding. Dairy products have been well-studied as probiotic sources and probiotic carriers with excellent results, however, alternative vehicles are also important in order to increase the food categories containing probiotics, hence making them available to everyone. In this context, this study focuses on (a) exploring traditionally fermented Greek products for the presence of lactic acid bacteria with probiotic potential (b) use these lactic acid bacteria as co-starters or adjunct cultures in fermented meat products (c) investigating the potential of alternative probiotic carriers, such as edible films in thermally-processed meat products (d) assessing Fourier-Transform Infrared Spectroscopy as a tool to predict the quality status of the above meat products. As a first step, lactic acid bacteria isolated from traditional greek fermented meat and dairy products were molecularly characterised and their probiotic potential was examined in vitro. Nineteen (19) out of 47 strains were selected as good probiotic candidates after a series of tests. Additionally, other LAB strains previously isolated from olives were also studied for probiotic attributes, with 17 of them showing good potential. These LAB strains were also studied for their ability to produce γ-aminobutyric acid and AI-2 signal molecules, with none of them being a producer of either compounds. Four of these strains were further investigated for their ability to produce AI-2, under stress conditions related to those encountered in foods and human gastrointestinal tract. In parallel, the gene expression of luxS (responsible gene for AI-2 production) under these stress conditions was monitored with Real-Time PCR. The results revealed a great variability on the expression levels amongst strains and the different stress factors, however, the levels were considered as generally low. At a second stage, selected lactic acid bacteria with probiotic potential were used as adjunct cultures for the preparation of fermented sausages. Microbiological, physicochemical (pH and aw) and sensory analyses were performed during fermentation, ripening and storage of the sausages at 4 and 12 °C. The presence of the probiotic strain was confirmed with PFGE till the end of the shelf-life. The results were very promising, since the adjunct cultures remained in high levels (> 6 log CFU/g), the potentially probiotic adjunct culture was found to possess desirable technological characteristics and the sensorial attributes of the new products were highly accepted. At a later stage, the efficacy of Na-alginate edible films as vehicles for delivering probiotic bacteria to sliced ham in combination with High Pressure Processing (HPP) was investigated. LAB strains with probiotic potential were incorporated in Na-alginate forming solution. Ham slices (pretreated or not with HPP: 500MPa for 2 min) were packed under vacuum in contact with the films and were then stored at 4, 8 and 12 °C for 66, 47 and 40 days, respectively. Microbiological and physicochemical (pH, aw) analysis was performed in parallel with color measurements. Sensory characteristics were assessed, while the presence and the relative abundance of each probiotic strain during storage was evaluated using PFGE. In ham slices without HPP treatment, probiotic bacteria were enumerated above 6 log CFU/g during storage at all temperatures. Similar results were obtained in cases of HPP treated samples, but pH measurements showed differences between the two treatments. Sensory evaluation revealed that probiotic samples had a more acidic taste and odor/smell than the control ones, however these characteristics were markedly compromised in samples treated with HPP. Generally, the results seemed promising since probiotic bacteria were successfully delivered in the products by edible films regardless of the HPP treatment. Simultaneously, a similar study was performed focusing on the antimicrobial activity of Na-alginate edible films supplemented with oregano essential oil on the pathogen Listeria monocytogenes when present in the same product with or without a HPP pre-treatment. The same analyses were performed as the previous study, while the presence/absence and the relative abundance of each L. monocytogenes strain during storage, was monitored using PFGE. Results showed that HPP had an effect on Listeria, regardless the storage temperature. The oregano essential oil incorporation in the films, caused ~1.5 log reduction in Listeria levels at 8 and 12 °C at the end of storage period, and almost 2.5 log reduction at 4 °C. The combined application of HPP and oregano essential oil edible films on the ham slices was the most effective treatment, causing a significant reduction or even absence of the pathogen, whilst having an effect on the other bacterial populations. At a final stage, the potential of FTIR spectroscopy as a tool to determine the quality of meat products supplemented with probiotics was assessed. The products examined were the ones produced previously, such as dry-fermented sausages, ham slices without any treatment (control case), ham slices with probiotic edible films and ham slices with edible films supplemented with probiotic cultures or oregano essential oil with or without HPP treatment. A series of Partial Least Squares (PLS) models were developed to correlate spectral data from FTIR analysis with spoilage during storage at different temperatures, according to the product studied. The scope of the modelling approach was to discriminate the products in their respective quality class and additionally to predict the microbial population directly from spectral data. The results obtained demonstrated that the processing of the samples affected the performance of classification in the sensory classes. The performance of PLS regression models on providing quantitative estimations of microbial counts were based on graphical plots and statistical indices (Bf, Af, RMSE, % PE). The results demonstrated for the first time that although FTIR has a potential to be used for the rapid assessment of many foods, additional processes such as fermentation, additives or HPP can affect its performance.