Phytochemical analysis and biological activity of selected Medicinal and Aromatic plants (Drimia numidica, Smilax aspera L., Rosmarinus officinalis L., Cannabis sativa L., Crocus sativus L.) against diabetes mellitus and cancer

Abstract

Medicinal and aromatic plants are widely used for their health promoting properties. Given the fact that the benefits from their use has been established through many in vitro and in vivo studies, it is a reasonable assumption that medicinal and aromatic plants will play a crucial role for human health in the future. In this thesis, the chemical profile and the in vitro and in vivo bioactivity of Drimia numidica, Smilax aspera L, Rosmarinus officinalis L, Crocus sativus L. and cannabidiol, the non-psychotropic compound of Cannabis sativa were studied. The chemical profile of the extracts was determined with the use of liquid chromatography combined with time-of-flight mass spectrometry while bioactivity of the extracts in terms of antioxidant activity was evaluated with the DPPH and ABTS assays. Estimation of the total phenolic content of the plant material was performed with the Folin Ciocalteu assay. Given the rich chemical profile of the extracts in secondary metabolites, followed by their strong or even moderate antioxidant activity, in vitro experiments regarding their cytotoxic activity as possible anticancer agents against brain malignances were performed. In these experiments it was also investigated the cytotoxic activity of dimethylcrocetin, a semi-natural derivate from the stigmas of Crocus sativus L. Medulloblastoma (TE671) and glioblastoma (A172) cancer cell lines were used and cytotoxicity was monitored at 24, 48 and 72h after treatment with the chemicals using the Alamar blue assay. Results showed that the plant material under study as well as the single compounds used, namely dimethylcrocetin and cannabidiol, inhibit cancer cell growth and proliferation in a dose and time dependent manner. In vivo experiments included the use of Crocus sativus L and specifically the use of crocins, the most abundant constituent of saffron stigmas. Experiments were performed using zebrafish as an experimental model. It was estimated whether crocins can regulate glucose levels of larvae zebrafish. A significant decrease of glucose levels was observed on the treated embryos; therefore, it was further investigated whether expression of pck1, the gene that regulates the rate limiting stem of gluconeogenesis is influenced by crocins. According to RT-PCR results, pck1 was significantly upregulated respect to the control treated embryos, indicating that reduction of glucose was not via inhibition of the gluconeogenesis pathway. However, since pancreatic β-cells secrete insulin to regulate glucose metabolism, it was examined if CRCs affect β-cells formation of developing zebrafish embryos. The transgenic line Tg(ins:DsRed) was used and results showed that treated embryos with the extract of crocins promoted insulin expression, as it was observed by the increased fluorescence intensity derived from the pancreatic islets. This was further confirmed by investigating the expression of insa. Insa was significantly upregulated compared to the control group, supporting the implication of the extract in glucose homeostasis.

Η χρήση των φαρμακευτικών και αρωματικών φυτών είναι σήμερα ευρέως διαδεδομένη λόγω των πολλαπλών ωφελειών της στην προαγωγή της καλής υγείας. Τα οφέλη από τη χρήση της έχουν επιβεβαιωθεί μέσα από in vitro και in vivo μελέτες, επομένως γίνεται αντιληπτό πως τα φαρμακευτικά και αρωματικά φυτά θα συνεχίζουν να διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο ως σημαντικοί παράγοντες με σκοπό την προάσπιση της υγείας. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η χημική σύσταση καθώς και η in vitro και in vivo βιοδραστικότητα εκχυλισμάτων προερχόμενων από τα φυτά Drimia numidica, Smilax aspera L, Rosmarinus officinalis L, Cannabis sativa L., Crocus sativus L., καθώς και της κανναβιδιόλης, της μη ψυχότροπης ουσίας που προέρχεται από το φυτό της Cannabis sativa. Το χημικό προφίλ των εκχυλισμάτων προσδιορίστηκε με τη μέθοδο της υγρής χρωματογραφίας συζευγμένης με φασματομετρία μάζας χρόνου πτήσης, ενώ η εκτίμηση της βιοδραστικότητας των εκχυλισμάτων ως της την αντιοξειδωτική της ικανότητα έγινε με της δοκιμασίες DPPH και ABTS. Η εκτίμηση του ολικού φαινολικού περιεχομένου πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu. Δεδομένου του πλούσιου χημικού προφίλ των εκχυλισμάτων σε δευτερογενείς μεταβολίτες και σε συνδυασμό με την ισχυρή ή ακόμη και μέτρια αντιοξειδωτική δράση της, έγιναν in vitro πειράματα που αφορούσαν στη διερεύνηση της κυτταροτοξικής της δράσης σε κακοήθεις όγκους εγκεφάλου. Σε αυτή τη σειρά των πειραμάτων εξετάστηκε και η κυτταροτοξική δράση της διμεθυλοκροκετίνης, της ημι-φυσικού παραγώγου προερχόμενου από τα στίγματα του Crocus sativus L. Εξετάστηκαν δυο κυτταρικές σειρές και συγκεκριμένα η σειρά ΤΕ671 (κύτταρα μυελοβλαστώματος) και η σειρά Α172 (κύτταρα γλοιοβλαστώματος). Η δράση των εκχυλισμάτων παρακολουθήθηκε σε τρεις χρονικές στιγμές, δηλαδή της 24, 48 και 72h, χρησιμοποιώντας την τεχνική Alamar blue. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το φυτικό υλικό που μελετήθηκε καθώς και οι καθαρές ουσίες, διμεθυλοκροκετίνη και κανναβιδιόλη, αναστέλλουν την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων με μία δόσο- και χρόνο- εξαρτώμενη σχέση. Στα in vivo πειράματα, μελετήθηκε η δράση εκχυλίσματος κροκινών οι οποίες εκχυλίστηκαν από τα στίγματα του φυτού Crocus sativus L. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ως πειραματικό μοντέλο το zebrafish, και εκτιμήθηκε εάν οι κροκίνες μπορούν να ρυθμίσουν τα επίπεδα γλυκόζης στο zebrafish. Παρατηρήθηκε σημαντική μείωση των επιπέδων της γλυκόζης της προνύμφες όπου χορηγήθηκαν κροκίνες. Ως εκ τούτου διερευνήθηκε η έκφραση του γονιδίου pck1, το οποίο ρυθμίζει τη διαδικασία της γλυκονεογένεσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική αύξηση έκφρασης του γονιδίου σε σχέση με τα έμβρυα στα οποία δεν χορηγήθηκαν κροκίνες, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μείωση της γλυκόζης που παρατηρήθηκε, δεν είναι αποτέλεσμα παρεμπόδισης της γλυκονεογένεσης. Στη συνέχεια εξετάστηκε εάν οι κροκίνες επηρεάζουν το σχηματισμό των β-κυττάρων σε προνύμφες zebrafish. Χρησιμοποιήθηκε η διαγονιδιακή σειρά Tg(ins:DsRed) και τα αποτελέσματα έδειξαν πως οι κροκίνες ενεργοποίησαν την παραγωγή ινσουλίνης, της παρατηρήθηκε από την αυξημένη ένταση φθορισμού των παγκρεατικών νησιδίων, το οποίο επιβεβαιώθηκε μελετώντας και την έκφραση του γονιδίου insa. Παρατηρήθηκε υπερέκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου σε σχέση με τα έμβρυα στα οποία δεν είχαν χορηγηθεί κροκίνες, γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι οι κροκίνες συμμετέχουν στη διαδικασία ομοιόστασης της γλυκόζης.