The purpose of this thesis is to study the effect of neurotransmitters on nerve cells and to develop advanced methods in the field of Neurobiology.
Neurotransmitters are a group of chemicals released by nerve endings that allow transmission of cell-to-cell signals. They can also be named as a chemical messenger or chemical transmitter because of their ability to transmit nerve impulses from one cell to the next throughout the nervous system. They play an important role in shaping everyday life and functions. Their precise number is unknown, but more than 200 chemical messengers have been uniquely recognized.
In recent years, a system of measuring the change in electrical potential of a single cell membrane or single-cell segment but at the cell population/tissue level has been developed. The Bioelectric Recognition Assay (BERA) is a method for detecting viruses and other bioactive substances based on the measurement of changes in the electrical properties of a cell group properly. It is possible to detect human and plant viruses in a specific, fast (less than 3 minutes), remarkably reproducible and economical way. The sensitivity of BERA is comparable to previous immunological, cytological and molecular techniques.
This doctoral thesis is divided into two sections. The first section deals with the investigation of the effect of dopamine on nerve cells and more specifically the development of a functional test for the study of the in vitro interaction of dopamine neurotransmitters with dopamine receptor-bearing nerve cells for the purpose of evaluating different drug targets. The idea is based on the extremely rapid measurement of changes observed in the electrical properties of cultured mouse neuroblastoma (N2a) cells. Analysing the experimental data, a relatively close relationship was observed between dopamine concentration and cell membrane potential. At lower concentrations of dopamine (nanomolar) membrane depolarization was observed, while at higher concentrations (micromolar) cell membrane hyperpolarization was observed. The use of eticlopride, a dopamine D2-receptor antagonist, resulted in concentration-dependent membrane depolarization. In addition, a significant attenuation of cell membrane hyperpolarization was observed when cells were treated with sodium chloride. As determined by cyclic voltammetry, the bioelectric response to dopamine was highly correlated with the pattern of dopamine overflow by N2a cells. The novel approach was additionally used to evaluate the dopaminergic activity of chaste tree extracts (Vitex agnus-castus) as well as the activity of two well-known antipsychotics, haloperidol and olanzapine. This new concept offers many promising prospects for the development of an advanced system for the rapid functional characterization of neurotransmitters agonists and antagonists.
The second section deals with the examination of the existence of non- chemical, distant cellular interactions between neuronal cells. The mechanism of cell-to- cell communication and the coordinated cellular responses they present are something that has been of great concern to the scientific community in recent years. The work in the present study focuses on non-chemical, distant cellular interactions (NCDCI) that are likely to be responsible for this communication. Recent experiments have suggested the field theory of conscious electromagnetic information (CEMI) as a possible explanation for this cell-to-cell communication. In the present work, using a bioelectric biosensor, we observed the emergence of distant communication between neuroblastoma cells providing evidence for this theory. This observation was made simultaneously with the observations of changes in the membrane potential of human SK-N-SH neuroblastoma cells that were physically separated from each other. The cells were divided into two groups naturally separated. In one group we had the "inducer" cells that were stimulated with dopamine, and in the other group, we had the "detector" cells which showed a synchronized response to the "inducer" cells, with the amplitude of the response decreasing as the distance increased. In order to investigate the nature of the mechanisms that cause the observed distant cell interactions, cell cultures were separated with barriers, which were non-transparent in certain frequency ranges of the electromagnetic radiation spectrum or treated with vinblastine, a vinca alkaloid, which binds tubulin, thereby inhibiting the assembly of microtubules. The mechanism responsible for cell-to-cell communication is discussed in accordance with the observed effects of coordinated changes in membrane potential.
Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της επίδρασης των νευροδιαβιβαστών σε νευρικά κύτταρα και η ανάπτυξη προηγμένων μεθόδων στον τομέα της Νευροβιολογίας.
Οι νευροδιαβιβαστές είναι μια ομάδα χημικών ουσιών που απελευθερώνονται από τις νευρικές απολήξεις και επιτρέπουν τη νευροδιαβίβαση, δηλαδή την ανταλλαγή σημάτων μεταξύ των νευρικών κυττάρων. Επίσης ονομάζονται ως χημικός αγγελιοφόρος ή χημικός πομπός λόγω της ικανότητάς τους να μεταδίδουν τα νευρικά σήματα από ένα νευρικό κύτταρο σε όλο το νευρικό σύστημα. Ο ακριβής αριθμός τους είναι άγνωστος, αλλά περισσότεροι από 200 χημικοί αγγελιοφόροι έχουν αναγνωριστεί.
Τα τελευταία χρόνια αναπτύχθηκε ένα σύστημα μέτρησης της μεταβολής του ηλεκτρικού δυναμικού μιας κυτταρικής μεμβράνης. Η Βιοηλεκτρική Μέθοδος Αναγνώρισης (Bioelectric Recognition Assay - BERA) είναι μια μέθοδος για την ανίχνευση ιών και άλλων βιοδραστικών ουσιών με βάση τη μέτρηση των αλλαγών στις ηλεκτρικές ιδιότητες μιας κυτταρικής ομάδας. Είναι δυνατό να ανιχνευθούν ανθρώπινοι και φυτικοί ιοί με συγκεκριμένο, γρήγορο (λιγότερο από 3 λεπτά) τρόπο, αξιοσημείωτα αναπαραγώγιμο και οικονομικό. Η ευαισθησία της μεθόδου BERA είναι συγκρίσιμη με προηγούμενες ανοσολογικές, κυτταρολογικές και μοριακές τεχνικές.
Η παρούσα διδακτορική διατριβή χωρίστηκε σε δυο ενότητες. Η πρώτη ενότητα αφορά την διερεύνηση της επίδρασης της ντοπαμίνης σε νευρικά κύτταρα και πιο συγκεκριμένα την ανάπτυξη μιας λειτουργικής δοκιμής για τη μελέτη της in vitro αλληλεπίδραση του νευροδιαβιβαστή ντοπαμίνη με νευρικά κύτταρα που φέρουν υποδοχείς ντοπαμίνης, με σκοπό την αξιολόγηση διαφόρων φαρμάκων που έχουν σαν στόχους υποδοχείς ντοπαμίνης. Η ιδέα βασίζεται στην εξαιρετικά ταχεία μέτρηση των αλλαγών που παρατηρούνται στις ηλεκτρικές ιδιότητες των καλλιεργημένων κυττάρων νευροβλαστώματος ποντικού (N2a). Αναλύοντας τα πειραματικά δεδομένα, παρατηρήθηκε μια σχετικά στενή σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης ντοπαμίνης και του δυναμικού κυτταρικής μεμβράνης. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις παρατηρήθηκε αποπόλωση της κυτταρικής μεμβράνης, ενώ σε υψηλότερες συγκεντρώσεις παρατηρήθηκε υπερπόλωση κυτταρικής μεμβράνης. Η χρήση της ετικλοπρίδης, ενός ανταγωνιστή των D2-υποδοχέων της ντοπαμίνης, οδήγησε σε εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αποπόλωση της μεμβράνης. Επιπλέον, παρατηρήθηκε σημαντική εξασθένιση του φαινομένου της υπερπόλωσης της κυτταρικής μεμβράνης όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με χλωριούχο νάτριο. Όπως προσδιορίζεται από την κυκλική βολταμετρία, η βιοηλεκτρική απόκριση στην ντοπαμίνη συσχετίζεται εξαιρετικά με το πρότυπο "υπερχείλισης" της ντοπαμίνης από τα κύτταρα N2a. Η νέα προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε επιπρόσθετα για την αξιολόγηση της ντοπαμινεργικής δραστικότητας των εκχυλισμάτων του φυτού λυγαριά (Vitex agnus-castus) καθώς και της δραστικότητας δύο γνωστών αντιψυχωτικών, της αλοπεριδόλης και της ολανζαπίνης. Αυτή η νέα ιδέα προσφέρει πολλές ελπιδοφόρες προοπτικές για την ανάπτυξη ενός προηγμένου συστήματος για τον γρήγορο χαρακτηρισμό των αγωνιστών και ανταγωνιστών των νευροδιαβιβαστών,
Η δεύτερη ενότητα αφορά τον έλεγχο της ύπαρξης μη χημικών, μακρινών κυτταρικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ νευρικών κυττάρων. Ο μηχανισμός της επικοινωνίας μεταξύ κυττάρου προς κύτταρο και οι συντονισμένες κυτταρικές αποκρίσεις που παρουσιάζουν είναι κάτι που έχει απασχολήσει ιδιαίτερα την επιστημονική κοινότητα τα τελευταία χρόνια. Οι περισσότερες εργασίες επικεντρώνονται στις μη χημικές, μακρινές κυτταρικές αλληλεπιδράσεις (NCDCI) που είναι πιθανό να είναι υπεύθυνες για αυτήν την επικοινωνία. Πρόσφατα πειράματα έχουν προτείνει την θεωρία πεδίου της συνειδητής ηλεκτρομαγνητικής πληροφορίας (CEMI) ως πιθανή εξήγηση για αυτή την επικοινωνία κυττάρου προς κύτταρο. Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιώντας έναν βιοηλεκτρικό βιοαισθητήρα, παρατηρήσαμε την εμφάνιση μακρινής επικοινωνίας μεταξύ κυττάρων νευροβλαστώματος τα οποία παρέχουν στοιχεία για αυτή τη θεωρία. Αυτή η παρατήρηση έγινε ταυτόχρονα με τις παρατηρήσεις μεταβολών στο δυναμικό μεμβράνης των ανθρώπινων κυττάρων νευροβλαστώματος SK-N-SH που φυσικά διαχωρίστηκαν μεταξύ τους. Τα κύτταρα χωρίστηκαν φυσικά σε δύο ομάδες. Σε μία ομάδα είχαμε τα "επαγωγικά" κύτταρα που διεγέρθηκαν με ντοπαμίνη, και στην άλλη ομάδα, είχαμε τα κύτταρα "ανιχνευτή" που έδειξαν συγχρονισμένη απόκριση στα κύτταρα "επαγωγέα", με το εύρος της απόκρισης να μειώνεται όταν η απόσταση αυξανόταν. Για να διερευνηθεί η φύση των μηχανισμών που προκαλούν τις παρατηρούμενες αλληλεπιδράσεις των κυττάρων, οι κυτταρικές καλλιέργειες διαχωρίστηκαν με φραγμούς που επιτρέπουν διαφορετικά μήκη κύματος να τους διαπερνούν ή υπεβλήθησαν σε επεξεργασία με βινβλαστίνη, ένα αλκαλοειδές, το οποίο δεσμεύει τη τουμπουλίνη, αναστέλλοντας έτσι τη συναρμολόγηση των μικροσωληνίσκων. Ο μηχανισμός που είναι υπεύθυνος για την επικοινωνία κυττάρου προς κύτταρο συζητείται σύμφωνα με τις παρατηρούμενες επιδράσεις των συντονισμένων αλλαγών στο δυναμικό της μεμβράνης.
