Παράγοντες που επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό υποκειμένων πυρηνοκάρπων

Abstract

Ο αγενής πολλαπλασιασμός αποτελεί το βασικό τρόπο αναπαραγωγής φυτών με ίδια γενετικά χαρακτηριστικά τόσο μεταξύ τους όσο και με το μητρικό φυτό από το οποίο προήλθαν. Μεταξύ των διαφόρων μεθόδων αγενούς πολλαπλασιασμού, ο πολλαπλασιασμός με μοσχεύματα βλαστού είναι ένας από τους πιο διαδεδομένους τρόπους αγενούς πολλαπλασιασμού των υποκειμένων πυρηνοκάρπων. Έκτος της χρήσης μοσχευμάτων και των άλλων μεθόδων, τα τελευταία χρόνια, αν και αποτελούσε αρχικά ένα χρήσιμο ερευνητικό εργαλείο, έχει αρχίσει να αναπτύσσεται και ο in vitro πολλαπλασιασμός, ως μέσο για τον εμπορικό πολλαπλασιασμό των προαναφερθέντων ειδών. Ωστόσο, μεταξύ των διαφόρων υποκειμένων παρατηρούνται σημαντικές διαφορές στο δυναμικό και την ικανότητα ριζοβολίας των μοσχευμάτων τους, αλλά και ως προς την ικανότητα βλαστογένεσης και ριζοβολίας σε in vitro συνθήκες. Αντικείμενο της παρούσας διατριβής απετέλεσε η μελέτη διαφόρων φυσιολογικών, βιοχημικών και θρεπτικών παραγόντων, οι οποίοι εμπλέκονται στη ριζοβολία φυλλοφόρων μοσχευμάτων, ξυλοποιημένων μοσχευμάτων και στη βλαστογένεση και ριζοβολία εκφύτων υποκειμένων πυρηνοκάρπων, τα οποία χαρακτηρίζονται από διαφορετικό δυναμικό ριζοβολίας. Για τη μελέτη των διαφόρων βιοχημικών παραμέτρων τα ξυλοποιημένα μοσχεύματα προέρχονταν από τα υποκείμενα ‘Cadaman’, ‘Myrobalan 29C’, ‘GF 677’ και ‘Rootpac R’, ενώ τα φυλλοφόρα από τα ‘Myrobalan 29C’ και ‘GF 677’. Για τα in vitro πειράματα επιλέχθηκε το υποκείμενο ‘Krymsk 5’, ενώ για τη μελέτη της επίδρασης διαφόρων ουσιών στη ριζοβολία επιλέχθηκαν τα υποκείμενα ‘Cadaman’, ‘Myrobalan 29C’, ‘GF 677’, ‘Garnem’ και ‘Krymsk 86’. Αρχικά (Kεφ. ΙΙο), για τη μελέτη των παραγόντων που εμπλέκονται στη ριζοβολία ξυλοποιημένων μοσχευμάτων υποκειμένων πυρηνοκάρπων μελετήθηκε η επίδραση του μήνα (Νοέμβριος, Δεκέμβριος, Ιανουάριος) και του τμήματος λήψης των μοσχευμάτων (κορυφαίο, μεσαίο, βασικό), από το μητρικό βλαστό, των υποκειμένων ‘GF 677’, ‘Cadaman’, ‘Rootpac R’ και ‘Myrobalan 29C’. Αναλύθηκαν επίσης, βιοχημικοί και θρεπτικοί παράγοντες όπως φαινολικά συστατικά, πολυαμίνες, σάκχαρα, άμυλο και θρεπτικά στοιχεία για να βρεθεί πιθανή συσχέτιση της ριζοβολίας με κάποιον από αυτούς. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων βρέθηκε ότι το ‘Cadaman’ χαρακτηριζόταν από το μικρότερο δυναμικό ριζοβολίας, ενώ το ‘Rootpac R’ από το υψηλότερο. Ο μήνας λήψης δεν είχε σημαντική επίδραση στο ποσοστό ριζοβολίας για το ‘GF 677’, ενώ το τμήμα είχε σημαντική επίδραση μόνο για το ‘Rootpac R’. Ωστόσο, δεν βρέθηκε άμεση σύνδεση συγκεκριμένου μήνα ή τμήματος με σταθερά υψηλά ή χαμηλά ποσοστά ριζοβολίας. Τέλος, δεν βρέθηκε συσχέτιση κάποιου βιοχημικού ή θρεπτικού παράγοντα με τη ριζοβολία μεταξύ των τεσσάρων υποκειμένων που μελετήθηκαν. Κατά το δεύτερο και τρίτο πείραμα μελετήθηκαν οι διακυμάνσεις διαφόρων βιοχημικών παραγόντων κατά τις πρώτες 15 ημέρες της ριζοβολίας τόσο ξυλοποιημένων όσο και φυλλοφόρων μοσχευμάτων των υποκειμένων πυρηνοκάρπων ‘Myrobalan 29C’ και ‘GF 677’. Μελετήθηκαν διάφορες ομάδες φαινολικών ενώσεων και μεμονωμένες φαινολικές ενώσεις, η διακύμανση υδατανθράκων (σακχάρων και αμύλου) και πολυαμινών, και οι μεταβολές των ενεργοτήτων διαφόρων ενζύμων σχετιζομένων με τη ριζοβολία. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων προέκυψε ότι και για τους δύο τύπους μοσχευμάτων το ‘GF 677’ ριζοβόλησε σε χαμηλότερα ποσοστά από το ‘Myrobalan 29C’. Στα φυλλοφόρα μοσχεύματα βρέθηκε ότι η συγκέντρωση των ελεύθερων πολυαμινών και ειδικότερα της ελεύθερης πουτρεσκίνης ήταν υψηλότερη στο ‘GF 677’, όμως το υποκείμενο χαρακτηριζόταν από χαμηλότερη ενεργότητα διάμινο-οξειδάσης (DAO) και υψηλότερη ενεργότητα καταλάσης (CAT). Kαι στους δύο τύπους μοσχευμάτων η συγκέντρωση του αμύλου ήταν υψηλότερη στο ‘Myrobalan 29C’. Επίσης, η συγκέντρωση των ταννινών ήταν χαμηλότερη στο ‘Myrobalan 29C’, ενώ τόσο η συγκέντρωση των φλαβανολών όσο και η συγκέντρωση των ο-κινονών ήταν υψηλότερη. Τέλος, η ενεργότητα της οξειδάσης του ινδολυλοξικού οξέος (ΙΑΑ-oxidase) ήταν χαμηλότερη για το συγκεκριμένο υποκείμενο, ανεξαρτήτως τύπου μοσχεύματος. Στο κεφάλαιο ΙΙΙ μελετήθηκε το υποκείμενο κερασιάς ‘Krymsk 5’ σε in vitro συνθήκες κατά τα στάδια της βλαστογένεσης και της ριζοβλίας. Εξετάστηκε η επίδραση διαφόρων κυτοκινινών στην βλαστογένεση όπως και η επίδραση διαφόρων πηγών άνθρακα για το ίδιο στάδιο. Βρέθηκε ότι η βενζυλ-αδενίνη (ΒΑ) ήταν η αποδοτικότερη κυτοκινίνη, ενώ αντικατάσταση της ευρέως χρησιμοποιούμενης σακχαρόζης από τη φρουκτόζη και από αναλογία σακχάρων που ανιχνεύθηκαν ενδογενώς, δύναται να βελτιώσει ορισμένες παραμέτρους βλαστογένεσης. Μελετήθηκε, επίσης, η επίδραση του pH με τα χαμηλότερα μεταποστειρωτικά pH να ευνοούν την παραγωγή αυξημένου αριθμού βλαστών και αριθμού κόμβων ανά έκφυτο. Τέλος, ελέγχθηκε η ανταπόκριση εκφύτων του υποκειμένου στις ουσίες θειϊκή αδενίνη, τριακοντανόλη, σεροτονίνη, μελατονίνη, ντοπαμίνη και αδρεναλίνη σε συνδυασμό με την αποδοτικότερη συγκέντρωση ΒΑ, με τα έκφυτα να ανταποκρίνονται θετικά στις τρεις πρώτες ουσίες. Για το στάδιο της ριζοβολίας, αρχικά, μελετήθηκε η επίδραση των αυξινών ινδολο-βουτυρικό οξύ (ΙΒΑ) και 1-ναφθαλινοξικό οξύ (1-ΝΑΑ), όπου με συνδυασμό τους επετεύχθη το μέγιστο ποσοστό ριζοβολίας των εκφύτων. Ακολούθως, συγκρίθηκαν τα ποσοστά ριζοβολίας των εκφύτων μεταξύ υποστρωμάτων, εφοδιασμένων με διαφορετικές πηγές άνθρακα, απουσία αυξινών και βρέθηκε ότι έκφυτα καλλιεργούμενα σε υπόστρωμα εφοδιασμένο με φρουκτόζη ριζοβόλησαν σε υψηλότερα ποσοστά. Ακόμη, από συνδυαστικά πειράματα μεταξύ του τμήματος του καλλιεργούμενου εκφύτου και του χρησιμοποιούμενου σακχάρου βρέθηκε ότι οι βλαστοκορυφές δύνανται να ριζοβολούν σε υψηλότερα ποσοστά από τα κομβικά έκφυτα, ενώ καλλιεργούμενες σε υπόστρωμα εφοδιασμένο με φρουκτόζη ριζοβόλησαν ταχύτερα από αντίστοιχου τύπου έκφυτα όταν αυτά καλλιεργήθηκαν σε υπόστρωμα με σακχαρόζη. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν δύο πειράματα στα οποία διερευνήθηκαν οι μεταβολές ορισμένων ενδογενών βιοχημικών παραγόντων στα έκφυτα κατά τις αρχικές φάσεις της in vitro ριζοβολίας (πρώτες 15 ημέρες παραμονής στο υπόστρωμα). Κατά το πρώτο πείραμα, έκφυτα τοποθετήθηκαν σε υποστρώματα ισομοριακών συγκεντρώσεων είτε φρουκτόζης είτε σακχαρόζης, ενώ κατά το δεύτερο είτε κομβικά έκφυτα είτε βλαστοκορυφές τοποθετήθηκαν σε υπόστρωμα που περιείχε φρουκτόζη. Από τις αναλύσεις των ενδογενών παραγόντων προέκυψε πως οι επεμβάσεις με την υψηλότερη ριζοβολία (δηλ. υπόστρωμα φρουκτόζης και βλαστοκορυφές) χαρακτηρίζονταν από σημαντικά υψηλότερη συγκέντρωση ο-κινονών, πουτρεσκίνης και ολικών πολυαμινών. Στο τελευταίο κεφάλαιο (Κεφ. IV) πραγματοποιήθηκαν επεμβάσεις για τη βελτίωση του δυναμικού της ριζοβολίας μοσχευμάτων και εκφύτων in vitro ύστερα από συνεκτίμηση των αποτελεσμάτων των κεφαλαίων II και III. Χρησιμοποιήθηκαν μοσχεύματα από τα υποκείμενα ‘GF 677’, ‘Cadaman’, ‘Myrobalan 29C’, ‘Garnem’ και ‘Krymsk 86’, ενώ για τις in vitro επεμβάσεις χρησιμοποιήθηκαν έκφυτα του υποκειμένου ‘Krymsk 5’. Βρέθηκε ότι η ηλικία της μητρικής φυτείας είχε αρνητική επίδραση επί της ριζοβολίας των ξυλοποιημένων μοσχευμάτων του υποκειμένου ‘GF 677’, ενώ ήταν απαραίτητη η χρήση αυξίνης για βελτίωση των ποσοστών ριζοβολίας. Επίσης, βρέθηκε ότι το H2O2 σε συνδυασμό με ΙΒΑ μπορεί να βελτιώσει το δυναμικό ριζοβολίας φυλλοφόρων μοσχευμάτων του ίδιου υποκειμένου, ενώ αντίστοιχη επίδραση είχε και η εφαρμογή σπερμίνης. Μελετήθηκε, επίσης, η επίδραση της μελατονίνης στη ριζοβολία φυλλοφόρων μοσχευμάτων των υποκειμένων ‘Myrobalan 29C’, ‘Garnem’, ‘Krymsk 86’ και ‘Cadaman’ από την οποία προέκυψε θετική επίδραση μόνο σε δύο από τα τέσσερα υποκείμενα (‘Myrobalan 29C’ και ‘Krymsk 86’), αρνητική σε ένα (‘Garnem’) και καμία επίδραση στο τέταρτο (‘Cadaman’). Επεμβάσεις με ντοπαμίνη αύξησαν το ποσοστό ριζοβολίας για τα φυλλοφόρα μοσχεύματα των ‘GF 677’ και ‘Cadaman’, ενώ στα ξυλοποιημένα μοσχεύματα δεν βρέθηκε αντίστοιχη επίδραση. Ακόμη, το χλωρογενικό οξύ αύξησε το ποσοστό ριζοβολίας των ξυλοποιημένων μοσχευμάτων του ‘Cadaman’ αλλά μόνο για το ένα από τα δύο έτη εφαρμογής. Τέλος, το ποσοστό ριζοβολίας φυλλοφόρων μοσχευμάτων του ‘Cadaman’ αυξήθηκε από την εφαρμογή των κινονών 1,4-benzoquinone και 2-hydroxy-1,4-naphthaquinone, ενώ για το ‘GF 677’ δεν παρατηρήθηκε αύξηση. Όσον αφορά τις in vitro επεμβάσεις σε έκφυτα, μελετήθηκε η επίδραση φαινολικών ενώσεων και κινονών στη ριζοβολία τους. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων βρέθηκε ότι η κινόνη 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone αύξησε σημαντικά τα ποσοστά ριζοβολίας απουσία ΙΒΑ, ενώ παρουσία ΙΒΑ η ντοπαμίνη, το χλωρογενικό οξύ, η 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone και η p-benzoquinone αύξησαν σημαντικά τα ποσοστά της in vitro ριζοβολίας. Συμπερασματικά, μπορεί να υποστηριχθεί ότι οι μεταβολές των διαφόρων βιοχημικών παραμέτρων πιθανώς να είναι σημαντικότερες από την αρχική τους συγκέντρωση σε σχέση με το δυναμικό ριζοβολίας των μοσχευμάτων. Επίσης, υποδηλώνεται ο ενδεχόμενος προωθητικός ρόλος του H2O2 και της οξειδάσης των διαμινών και ο παρεμποδιστικός της καταλάσης, ενώ επαναλαμβάνεται ο παρεμποδιστικός ρόλος της ΙΑΑ οξειδάσης κατά τις αρχικές φάσεις της ριζοβολίας. Ακόμη, επιβεβαιώνεται η ευνοϊκή επίδραση της 6-benzyladenine, αλλά και ουσιών οι οποίες προκαλούν τη συσσώρευση ενδογενώς παραγόμενων κυτοκινινών, στην in vitro βλαστογένεση των Prunus. Προτείνεται, επίσης, ο πειραματισμός με διάφορα σάκχαρα πριν την επιλογή του πλέον κατάλληλου. Επιπροσθέτως, φάνηκε ότι μπορεί να υπάρξουν περιπτώσεις ειδών που δύναναται, απουσία αυξινών, να ριζοβολήσουν in vitro σε υψηλά ποσοστά με το τμήμα του εκφύτου και το επιλεχθέν σάκχαρο να επηρεάζουν τη ριζοβολία. Τέλος, οι ο-διφαινόλες ντοπαμίνη και χλωρογενικό οξύ αλλά και διάφορες κινόνες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη βελτίωση του δυναμικού ριζοβολίας.

In the present study, the role of physiological, biochemical, and nutritional factors involved in the rooting of hardwood and softwood cuttings and shoot proliferation and rooting of explants were examined. In order to assess the role of the biochemical factors, hardwood cuttings from ‘Cadaman’, ‘Myrobalan 29C’, ‘GF 677’ and ‘Rootpac R’ and softwood cuttings from ‘Myrobalan 29C’ and ‘GF 677’ Prunus rootstocks were used. The ‘Krymsk 5’ cherry rootstock was selected for the experiments conducted in vitro, whereas ‘Cadaman’, ‘Myrobalan 29C’, ‘GF 677’, ‘Garnem’ and ‘Krymsk 86’ prunus rootstocks were chosen for the exogenous applications. In order to elucidate the role of the factors involved in rooting of Prunus hardwood cuttings, were assessed cuttings from the ‘GF 677’, ‘Cadaman’, ‘Rootpac R’ and ‘Myrobalan 29C’ Prunus rootstock derived from different parts of the mother shoot (the upper, intermediate and lower part) and excised in different months (November, December, and January). Several biochemical factors such as phenolic compounds, polyamines, sugars, starch, and nutrient elements were analyzed to find possible relations between them and the rooting potential. The results showed that ‘Cadaman’ was characterized by the lowest rooting potential, whereas ‘Rootpac R’ by the highest. The part of the mother shoot had a significant effect only for ‘Rootpac R’, whereas the month of excision did not affect ‘GF 677’. However, there was no direct relation between any month or part and rooting. Moreover, there was no correlation between the biochemical factors and rooting potential for any rootstock. In the second and third experiments, the objective was to study the changes of some biochemical factors during the first 15 days of rooting in softwood and hardwood cuttings of ‘Myrobalan 29C’ and ‘GF 677’ Prunus rootstocks. The changes of the phenolic compounds, carbohydrates (sugars and starch), polyamines, and the activity of enzymes related to rooting, were studied. The results showed that the rooting potential of ‘GF 677’ was lower than ‘Myrobalan 29C’ for both types of cuttings. Higher content of free putrescine was estimated in ‘GF 677’ softwood cutting than ‘Myrobalan 29C’. Also, ‘GF 677’ was characterized by lower DAO and higher CAT activity than ‘Myrobalan 29C’. Starch content was higher in ‘Myrobalan 29C’ than ‘GF 677’ for both types of cuttings. Furthermore, ‘Myrobalan 29C’ was characterized by a lower titer of condensed tannins and higher content of flavanols and o-quinones than ‘GF 677’. Moreover, the activity of the IAA-oxidase enzyme in ‘Myrobalan 29C’ was lower than ‘GF 677’ irrespectively of cutting type. In the third chapter in vitro shoot multiplication and in vitro rooting of ‘Krymsk 5’ cherry rootstock, were studied. Several cytokinins, sugars, different levels of pH, and other substances were tested during the multiplication stage. The cytokinin BA was the most efficient among the others tasted, whereas sucrose replacement by fructose and an endogenous sugar ratio improved some of the estimated variables. Moreover, lower pH levels after autoclaving favored shoot and node production. The effect of adenine sulphate, triacontanol, serotonin, melatonin, dopamine, and the adrenaline was also examined. From the substances mentioned, adenine sulphate, triacontanol, and serotonin combined with BA enhanced shoot multiplication. As far as in vitro rooting stage, auxins (IBA and 1-NAA), sugars (sucrose, fructose, glucose, and sorbitol), and explants' type (nodal explants and shoot tips) were studied, concerning their effect on the rooting potential of explants. Combination of the two auxins, and fructose without any auxin supplementation in the substrate, induced high rooting percentages. Moreover, shoots tips showed higher rooting potential than nodal explants, whereas the explants that cultivated in substrates supplemented with fructose rooted faster than those cultivated in sucrose. Finally, the changes of some endogenous biochemical factors during the initial stages of in vitro rooting were elucidated by conducting two experiments. In the first experiment, explants were cultivated in substrates with equal molarity of sucrose or fructose, whereas in the second experiment shoot tips or nodal explants were cultivated in substrate supplied with fructose. The results showed that treatments with high rooting potential were related to higher o-quinone, putrescine, and total polyamines titers. In the last chapter (Chapter IV), were conducted treatments in cuttings (softwood or hardwood) and explants aiming to rooting potential improvement, based on the results obtained from the previous experiments. ‘GF 677’, ‘Cadaman’, ‘Myrobalan 29C’, ‘Garnem’ and ‘Krymsk 86’ rootstocks were used for cuttings experiments, whereas ‘Krymsk 5’ explants were used for the in vitro experiments. The results showed that the age of the mother plant may have a negative impact on the rooting potential of ‘GF 677’ hardwood cuttings, whereas the use of auxin is a prerequisite for successful rooting. Moreover, H2O2 or spermine combined with IBA increased the rooting of ‘GF677’ softwood cuttings. Melatonin application increased rooting for ‘Myrobalan 29C’ and ‘Krymsk 86’ softwood cuttings, decreased rooting for ‘Garnem’ softwood cuttings, and had no effect on ‘Cadaman’ softwood cuttings. Dopamine favored rooting in ‘GF 677’ and ‘Cadaman’ softwood cuttings but not in hardwood cuttings for the same rootstocks. However, chlorogenic acid increased rooting potential in hardwood cuttings of the previous rootstock but only in the first year of experiments, whereas 1,4-benzoquinone and 2-hydroxy-1,4-naphthaquinone increased the rooting potential of ‘Cadaman’ softwood cuttings. As far as, in vitro applications are concerned, 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone increased in vitro rooting of ‘Krymsk 5’ explants in absence of IBA, whereas chlorogenic acid, dopamine, 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone, and p-benzoquinone increased rooting potential in presence of IBA. In conclusion, it can be supported that the fluctuation of the biochemical factors studied is more significant than their initial concentration concerning rooting. It is also indicated the possible enchasing role of H2O2 and diamine oxidase, the potential inhibiting role of catalase, and the inhibiting role of IAA-oxidase during the early stages of rooting. Moreover, the favoring effect of 6-benzyladenine and other substances that increase the endogenously produced cytokinins during in vitro shoot proliferation in Prunus is confirmed. It is also proposed the test of different sugars before the selection of the most appropriate for each in vitro stage. In addition, it was highlighted that in some species high in vitro rooting can occur, even in absence of auxin, depending on the shoot part and the selected sugar. Finally, several quinones, as well as the o-diphenols, dopamine, and chlorogenic acid, could be used to improve rooting potential.