Study of succinic acid production via fermentation using the organic fraction of municipal solid waste and process development using a novel electrochemical bioreactor

Abstract

The development of novel sustainable bioprocesses is an important target for the industrial transition towards the circular bio-economy era to minimise the use of fossil resources. The production of bio-based products from renewable feedstocks will enhance the sustainable production of bio-based chemicals. This PhD thesis presents novel research on bioprocess development for the production of succinic acid from the valorisation of organic fraction of municipal solid waste. Succinic acid could be used as precursor for the production of various bio-based products contributing greatly to the sustainable development of the chemical industry. The study was initiated with the statistical optimization of fermentation medium composition for Basfia succiniciproducens JF4016, signifying that NaH2PO4∙H2O, Na2HPO4 and NaCl are the most important salts in the fermentation medium. Response surface methodology was implemented to identify the optimum concentrations of the statistically significant factors, yeast extract and corn steep liquor leading to the highest productivity. Validation of the model predictions was performed in a lab-scale bioreactor. The optimised fermentation medium contained 19.4 g/L CSL, 9.2 g/L yeast extract, 3 g/L NaCl and 4.32 g/L sodium phosphates. This medium resulted in a succinic acid production of 17.7 g/L with 0.59 g/g yield and 1.47 g/(L·h) productivity, while the cost of the fermentation medium was estimated at 1.22 $/kgSA. Subsequently, the composition of liquid and solid fractions of OFMSW hydrolysates was determined. The effect of initial carbon source concentration was evaluated using three different bacterial strains to select the most promising one for succinic acid production. The effect of substrate concentration on succinic acid synthesis was investigated by varying initial OFMSW hydrolysate concentration for the bacterial strains B. succiniciproducens JF 4016 and Actinobacillus succinogenes 130Z. Fermentations using the OFMSW hydrolysate enhanced productivity as compared to the commercial medium, namely 52% higher productivity for B. succiniciproducens and 32% higher productivity for A. succinogenes. Fed-batch fermentations on OFMSW hydrolysates were carried out with A. succinogenes at ca. 50 g/L initial carbon source concentration, where yield, productivity and by-product to succinic acid ratio were optimum. The effect of different initial MgCO3 concentration, yeast extract and corn steep liquor supplementation were evaluated using OFMSW hydrolysate as feedstock on succinic acid production. Yeast extract supplementation (5 g/L) resulted in significantly higher succinic acid concentration (34.3 g/L) and productivity (0.75 g/(L·h)), while the highest by-product to succinic acid ratio (0.59) was also obtained among all fed-batch fermentations. In order to achieve higher succinic acid production, OFMSW hydrolysate was implemented as carbon and nutrient source for succinic acid production utilizing the bacterial strain A. succinogenes via continuous fermentation strategy with free cells and immobilisation of the cells at different dilution rates. The highest productivity achieved using glucose-based synthetic medium and OFMSW hydrolysate was 1.7 g/(L·h) and 1.4 g/(L·h), respectively, at a dilution rate of 0.08 h-1. By increasing the cell density in the bioreactor, through cell immobilization, product formation rates, yields and productivities have been enhanced. The productivity was increased by 32.8% in a glucose-based medium where succinic acid concentration was 28.3 g/L, while in the case of OFMSW hydrolysate the productivity was increased by 22.8% with a succinic acid concentration of 26.2 g/L at a dilution rate of 0.08 h-1 in both cases. Succinic acid production rate was improved during continuous operation mode. Besides bacterial strains, the engineered Yarrowia lipolytica PSA02004 strain was employed for succinic acid production utilizing OFMSW hydrolysate. The effect of kLα and different pH regulation strategies were evaluated in order to enhance succinic acid production efficiency and reduce NaOH requirements during fermentation. A batch fermentation using OFMSW hydrolysate was carried out at the optimum kLα value of 183.2 h-1 resulting in the final succinic acid concentration of 42.2 g/L with a yield of 0.38 g/g and productivity of 0.84 g/(L·h). The optimum kLα in fed-batch culture resulted in 48.7 g/L succinic acid with 0.37 g/g yield and 0.49 g/(L·h) productivity. The gradual reduction of pH from 6 to 5.5 at 30 h resulted in 54.4 g/L succinic acid with 0.44 g/g yield and 0.82 g/(L·h) productivity as well as 43% lower NaOH consumption. A novel process was employed in fed-batch Y. lipolytica PSA02004 cultures that integrates succinic acid production via fermentation and in situ extraction of produced carboxylic acids from fermentation broth with membrane electrolysis. The impact of different pH strategies on the fermentation efficiency of succinic acid using the electrochemical in-line extraction during fed-batch bioreactor fermentation were evaluated. The electrochemical cell integrated with the bioreactor at 30 h fermentation combined with gradual reduction of pH from 6 to 5.5 at the same time resulted in succinic acid production of 66.7 g/L. The productivity achieved was 0.78 g/(L·h), which was the highest value among all fed-batch fermentations carried out using the integrated system utilizing OFMSW hydrolysate. The overall succinic acid to substrate conversion yield was 0.51 g/g. The hydroxide anions (OH−) production at the cathode compartment contributed to lower NaOH usage for maintaining fermentation pH. Around 36% less NaOH was required for pH control during fermentation when the electrochemical bioreactor was used. Scale-up of the fermentation process in a semi-pilot scale bioreactor (30 L) was applied using the volumetric oxygen mass transfer coefficient (kLa) as the scale-up parameter. The novel process for in-situ succinic acid recovery from fermentation broth was established resulting in very-high purity succinic acid crystals (99.95% w/w).

Η μετάβαση της χημικής βιομηχανίας προς την εποχή της κυκλική βιοοικονομίας μέσω της ανάπτυξη καινοτόμων και βιώσιμων βιοδιεργασιών έχει ως σκοπό την ελαχιστοποίηση της χρήσης ορυκτών πόρων. Η βιοτεχνολογική παραγωγή προϊόντων από ανανεώσιμες πρώτες ύλες έχει ως στόχο την ενίσχυση της βιωσιμότητας. Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στην ανάπτυξη καινοτόμων βιοδιεργασιών για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος με χρήση του οργανικού κλάσματος αστικών στερεών απορριμμάτων. Το βιοτεχνολογικά παραγόμενο ηλεκτρικό οξύ θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως πρόδρομος ουσία για την παραγωγή βιογενών προϊόντων, συμβάλλοντας σημαντικά στη βιώσιμη ανάπτυξη της οικονομίας. Αρχικά πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση της σύνθεσης του θρεπτικού μέσου ζύμωσης για το βακτηριακό στέλεχος Basfia succiniciproducens JF4016. Τα θρεπτικά συστατικά NaH2PO4∙H2O, Na2HPO4 και NaCl είναι απαραίτητα για το θρεπτικό μέσο της ζύμωσης. Στη συνέχεια εφαρμόστηκε μεθοδολογία απόκρισης επιφανείας (RSM) για τον προσδιορισμό των βέλτιστων συγκεντρώσεων των στατιστικά σημαντικών παραγόντων, του εκχυλίσματος ζύμης και του υγρού εκχυλίσματος από την επεξεργασίας σπόρων καλαμποκιού (CSL). Η επικύρωση των προβλέψεων του μοντέλου πραγματοποιήθηκε σε βιοαντιδραστήρα εργαστηριακής κλίμακας. Η σύσταση του βελτιστοποιημένου θρεπτικού μέσου ζύμωσης αποτελείτο από 19,4 g/L CSL, 9,2 g/L εκχυλίσματος ζύμης, 3 g/L NaCl και 4,32 g/L φωσφορικών αλάτων. Πραγματοποιήθηκε ασυνεχής ζύμωση με το βελτιστοποιημένο θρεπτικό μέσο. Η τελική συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος ήταν 17,7 g/L με απόδοση 0,59 g/g και παραγωγικότητα 1,47 g/(L·h), ενώ το κόστος του θρεπτικού μέσου ζύμωσης εκτιμήθηκε σε 1,22 $/kgSA. Πραγματοποιήθηκε χαρακτηρισμός του υγρού και στερεού κλάσματος στο υδρόλυμα οργανικού κλάσματος αστικών στερεών αποβλήτων (ΑΣΑ). Σε πρώτο στάδιο η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης πηγής άνθρακα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τρία διαφορετικά βακτηριακά στελέχη με εμπορικά σάκχαρα, με σκοπό να επιλεχθεί το αποδοτικότερο ως προς την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος. Έπειτα, περαιτέρω μελέτη της αρχικής συγκέντρωσης πηγής άνθρακα πραγματοποιήθηκε μέσω της μεταβολής της αρχικής συγκέντρωσης του υδρολύματος οργανικού κλάσματος ΑΣΑ για τα βακτηριακά στελέχη B. succiniciproducens και Actinobacillus succinogenes 130Z. Η χρήση του υδρολύματος οργανικού κλάσματος ΑΣΑ ως πηγή άνθρακα στις ασυνεχείς ζυμώσεις είχαν ως αποτέλεσμα αυξημένη παραγωγικότητα και στις δύο περιπτώσεις σε σύγκριση με το εμπορικό μέσο. Παρατηρήθηκε αύξηση 52% στην περίπτωση του βακτηριακού στελέχους B. succiniciproducens και 32% στην περίπτωση του A. succinogenes. Ημι-συνεχείς ζυμώσεις με τη χρήση του υδρολύματος οργανικού κλάσματος ΑΣΑ πραγματοποιήθηκαν με το βακτηριακό στέλεχος Α. succinogenes. Επιλέχθηκε η αρχική συγκέντρωση πηγής άνθρακα 50 g/L, όπου η απόδοση, η παραγωγικότητα και η αναλογία παραπροϊόντων προς ηλεκτρικό οξύ ήταν βέλτιστες. Η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης MgCO3, η προσθήκη εκχυλίσματος ζύμης και CSL αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το υδρόλυμα οργανικού κλάσματος ΑΣΑ ως πρώτη ύλη για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος. Η προσθήκη εκχυλίσματος ζύμης (5 g/L) ως πηγή αζώτου στο υδρόλυμα οργανικού κλάσματος ΑΣΑ είχε ως αποτέλεσμα την υψηλότερη συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος (34,3 g/L), με παραγωγικότητα 0,75 g/(L·h) και αναλογία παραπροϊόντων προς ηλεκτρικό οξύ 0,59 g/g. Προκειμένου να επιτευχθεί υψηλότερη παραγωγή ηλεκτρικού οξέος, το υδρόλυμα οργανικού κλάσματος ΑΣΑ αξιοποιήθηκε ως πηγή άνθρακα και θρεπτικών συστατικών για παραγωγή ηλεκτρικού οξέος χρησιμοποιώντας το βακτηριακό στέλεχος A. succinogenes σε συνεχής ζυμώσεις με ελευθέρα κύτταρα και ακινητοποίηση των κυττάρων σε διαφορετικούς ρυθμούς αραίωσης. Η υψηλότερη παραγωγικότητα που επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας γλυκόζη και το υδρόλυμα οργανικού κλάσματος ΑΣΑ ως πηγή άνθρακα ήταν 1,7 g/(L·h) και 1,4 g/(L·h) αντίστοιχα, σε ρυθμό αραίωσης 0.08 h-1. Με την αύξηση της συγκέντρωσης των κυττάρων στον βιοαντιδραστήρα, μέσω της ακινητοποίησης των κυττάρων, αυξήθηκε ο βαθμός μετατροπής σακχάρων σε ηλεκτρικό οξύ και η παραγωγικότητα της ζύμωσης. Η παραγωγικότητα αυξήθηκε κατά 32,8% στη γλυκόζη, όπου η συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος ήταν 28,3 g/L, ενώ στην περίπτωση του υδρολύματος οργανικού κλάσματος ΑΣΑ η παραγωγικότητα αυξήθηκε κατά 22,8% με τη συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος να είναι ίση με 26,2 g/L σε ρυθμό αραίωσης 0.08 h-1 και στις δύο περιπτώσεις. Ο ρυθμός παραγωγής ηλεκτρικού οξέος βελτιώθηκε κατά τη συνεχή ζύμωση. Εκτός από τα βακτηριακά στελέχη, το γενετικά τροποποιημένο στέλεχος Yarrowia lipolytica PSA02004 μελετήθηκε για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος χρησιμοποιώντας το υδρόλυμα οργανικού κλάσματος ΑΣΑ. Η επίδραση του ογκομετρικού συντελεστή μεταφοράς μάζας οξυγόνου (kLα) και διαφορετικές στρατηγικές ρύθμισης pΗ κατά την διάρκεια ημι-συνεχών ζυμώσεων αναπτύχθηκαν με σκοπό τη βελτιστοποίηση της παραγωγής ηλεκτρικού οξέος και τη ταυτόχρονη μείωση της χρήσης καυστικού νατρίου (NaOH). Πραγματοποίηση ασυνεχούς ζύμωσης σε βιοανιδραστήρα χρησιμοποιώντας το υδρόλυμα οργανικού κλάσματος ΑΣΑ στη βέλτιστη τιμή kLα (183,2 h-1) είχε ως αποτέλεσμα η συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος να είναι ίση με 42,2 g/L με απόδοση 0,38 g/g και παραγωγικότητα 0,84 g/(L·h). Η σταδιακή μείωση του pΗ από 6 σε 5,5 στις 30 ώρες ζύμωσης είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της παραγωγής ηλεκτρικού οξέος (54,4 g/L) με απόδοση 0,44 g/g και παραγωγικότητα 0,82 g/(L·h) καθώς και 43% λιγότερη κατανάλωση NaOH κατά τη διάρκεια της ημι-συνεχούς ζύμωσης. Τέλος, πραγματοποιήθηκε η εφαρμογή μιας καινοτόμου τεχνολογίας σε καλλιέργειες ημιδιαλείποντος έργου χρησιμοποιώντας το γενετικά τροποποιημένο στέλεχος Y. lipolytica PSA02004. Με την τεχνολογία αυτή επιτυγχάνεται παραγωγή ηλεκτρικού οξέος μέσω ζύμωσης με ταυτόχρονο διαχωρισμό του ηλεκτρικού οξέος μέσω μίας ηλεκτροχημικής κυψέλης στην οποία χρησιμοποιείται μία ανιονική μεμβράνη. Εφαρμόζοντας το ηλεκτροχημικό κελί σε ημι-συνεχείς ζυμώσεις αξιολογήθηκε η επίδραση των διαφορετικών στρατηγικών ρύθμισης του pH στην αποτελεσματικότητα της ζύμωσης για την παραγωγή του ηλεκτρικού οξέος. Η ενσωμάτωση του ηλεκτροχημικού κελιού με τον βιοαντιδραστήρα στις 30 ώρες ζύμωσης σε συνδυασμό με τη σταδιακή μείωση του pΗ από 6 σε 5,5 είχε ως αποτέλεσμα η συγκέντρωση του ηλεκτρικού οξέος να είναι ίση με 66,7 g/L. Η παραγωγικότητα που επιτεύχθηκε ήταν 0,78 g/(L·h), η οποία ήταν η υψηλότερη τιμή μεταξύ όλων των ζυμώσεων ημι-διαλείποντος έργου που πραγματοποιήθηκαν με το ηλεκτροχημικό κελί και τη χρήση του υδρολύματος οργανικού κλάσματος ΑΣΑ. Η συνολική απόδοση μετατροπής σε ηλεκτρικό οξύ ήταν 0,51 g/g. Η παραγωγή ανιόντων υδροξειδίου (OH−) στη κάθοδο του ηλεκτροχημικού κελιού συνέβαλε σε μικρότερη κατανάλωση NaOH για τη διατήρηση του pH κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Περίπου 36% λιγότερο NaOH απαιτήθηκε όταν χρησιμοποιήθηκε ο ηλεκτροχημικός βιοαντιδραστήρας. Η κλιμάκωση της διαδικασίας ζύμωσης σε βιοαντιδραστήρα ημι-πιλοτικής κλίμακας (30 L) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το kLa ως παράμετρος κλιμάκωσης. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανάκτηση του ηλεκτρικού οξέος, του οποίο ο διαχωρισμός από το υγρό ζύμωσης επιτεύχθηκε μέσω της εφαρμογής ηλεκτροχημικού κελιού, με αποτέλεσμα την ανάκτηση κρυστάλλων ηλεκτρικού οξέος με υψηλή καθαρότητα (99,95% κβ.).