Physiological and molecular aspects of sublethally injured Listeria monocytogenes cells

Abstract

Antimicrobial practices of the food industry that aim to eliminate the presence of pathogenic bacteria can cause sublethal injury. The presence of injured cells that survive an antimicrobial treatment is crucial for food quality and safety. Sublethally injured cells may maintain part of their functionality or may gain improved stress resistance after they are repaired. L. monocytogenes is a pathogenic bacterium that can adapt to the adverse conditions encountered in the food processing environment and therefore poses a major food safety concern. This versatile bacterium exists as a saprophyte and an intracellular pathogen. During its saprophytic life cycle it can attach to surfaces and form biofilms which allow it to persist in the food processing environment and become a contamination source. As an intracellular pathogen, L. monocytogenes can withstand the host’s barriers, invade and proliferate in the host’s cells and therefore cause illness (listeriosis). Sublethal injury can be structural or metabolic and it can potentially affect the mechanisms involved in its resistance, surface attachment and virulence. Understanding the occurrence of sublethal damage and the physiology of injured L. monocytogenes can increase the accuracy of food safety decision-making. The objective of this research was to understand the occurrence of sublethal injury in L. monocytogenes under different conditions related to food processing and to investigate the physiological and molecular characteristics of sublethally injured cells. The approach followed to reach these objectives was, at first, to quantify the sublethal injury under various stress conditions. Based on these findings, further experiments focused on the physiological and molecular characteristics of the injured L. monocytogenes, namely the in vitro virulence potential, surface attachment and relative transcription of virulence- and stress-associated genes. Finally, the effect of preculturing temperature on L. monocytogenes stress response and injury was evaluated as well as the growth potential of cells treated with an injury-inducing stress of peracetic acid. In chapter 2, it was demonstrated that the antimicrobial factors, which aim to eliminate the pathogen, can induce sublethal injury. Each stress (i.e. benzalkonium chloride, peracetic acid, lactic acid, heating, glycerol and starvation stress in high salinity) had a different impact on the survival and injury kinetics of L. monocytogenes ScottA and EGDe. The highest injury levels were caused by the disinfectant peracetic acid (PAA) followed by lactic acid and heating. The exposure temperature (4oC and 20oC) contributed to the inactivation mode as well as the mode of injury. Habituation of cells in a nutrient-limited and high salinity medium affected L. monocytogenes survival and injury when subsequently exposed to the disinfectants PAA and benzalkonium chloride. In chapter 3, it was demonstrated that PAA-injured L. monocytogenes cells maintain important physiological properties. Injured cells were able to attach (after 2 and 24h) on stainless steel surfaces at 4oC and 20oC. In vitro virulence assays using human intestinal epithelial Caco-2 cells showed that injured L. monocytogenes could invade the host’s cells but could not proliferate intracellularly. Incubation of injured L. monocytogenes ScottA in nutrient-rich medium resulted in an upregulation of the key virulence genes flaA, inlA and plcA. Strain-dependent differences in the virulence potential of injured cells also were observed. In chapter 4, physiological aspects regarding the outgrowth potential of stressed and injured cells were investigated as well as the effect of preculture temperature on injury and recovery of L. monocytogenes. Preculturing of cells at 20oC or 4oC caused higher injury (compared to cells grown in the optimum temperature of 30oC) when subsequently exposed to PAA 20oC and PAA 4oC, respectively. The stress and injury caused by PAA affected the outgrowth of L. monocytogenes on a single-cell level. Importantly, the outgrowth times in a nutrient-rich liquid medium were extended and variable. In conclusion, the work presented in this thesis aims to highlight the impact of sublethally injured L. monocytogenes on food safety. The findings underline that the pathogen, after the application of an antimicrobial treatment, can survive in a sublethally injured state while maintaining important cellular functions (i.e. surface attachment and cellular invasion) which enable it to persist in the food processing environment with the potential to cause illness. Furthermore, the highly variable growth potential of injured cells, can affect their detection accuracy. The quantitative data of this study can be used for the development of models that predict the sublethal injury of the pathogen. Also, the results on the phenotypic and transcriptional response can contribute to a better understanding of the mechanisms underlying the response of the injured L. monocytogenes inside the host and in the food processing environment.

Οι αντιμικροβιακές πρακτικές που εφαρμόζονται στη βιομηχανία τροφίμων με στόχο τον περιορισμό των παθογόνων βακτηρίων μπορούν να προκαλέσουν υποθανατiο τραυματισμό. Η παρουσία τραυματισμένων κυττάρων που επιβιώνουν μετά από μία αντιμικροβιακή πρακτική είναι ζωτικής σημασίας για την ασφάλεια και την ποιότητα των τροφίμων. Τα υποθανάτια τραυματισμένα κύτταρα μπορεί να διατηρήσουν ένα μέρος της λειτουργικότητάς τους ή μπορεί να ανακτήσουν βελτιωμένη ανθεκτικότητα σε καταπονήσεις αφού ανακάμψουν από τον τραυματισμό. Ο μικροοργανισμός L. monocytogenes είναι ένα παθογόνο βακτήριο που μπορεί να προσαρμοστεί σε ένα ευρύ φάσμα συνθηκών που συναντώνται στο περιβάλλον επεξεργασίας τροφίμων και ως εκ τούτου αποτελεί σημαντικό κίνδυνο για την ασφάλεια των τροφίμων. Αυτό το βακτήριο επιβιώνει ως σαπρόφυτο και ως ενδοκυτταρικό παθογόνο. Κατά τη διάρκεια του σαπροφυτικού κύκλου ζωής του, μπορεί να προσκολληθεί σε επιφάνειες και να σχηματίσει βιο-υμένιο, κάτι που το βοηθά να παραμένει στο περιβάλλον επεξεργασίας τροφίμων για μεγάλο χρονικό διάστημα και να αποτελέσει πηγή επιμόλυνσης. Ως ενδοκυτταρικό παθογόνο, το βακτήριο L. monocytogenes μπορεί να επιβιώσει από τα εμπόδια που απαντώνται στο περιβάλλον του ξενιστή, να εισβάλει και να πολλαπλασιαστεί στα κύτταρά του και ως εκ τούτου να προκαλέσει ασθένεια (λιστερίωση). Ο υποθανάτιος τραυματισμός μπορεί να είναι δομικός ή μεταβολικός, επηρεάζοντας δυνητικά τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα σε καταπονήσεις, την προσκόλληση σε επιφάνειες και την μολυσματικότητά του. Πληροφορίες για τη εμφάνιση υποθανάτιου τραυματισμού σε συνθήκες επεξεργασίας τροφίμων αλλά και για τη φυσιολογία του τραυματισμένου L. monocytogenes μπορεί να αυξήσουν την αποτελεσματικότητα των αποφάσεων που λαμβάνονται σχετικά με την ασφάλεια των τροφίμων. Ο στόχος αυτής της διατριβής ήταν η κατανόηση της εμφάνισης υποθανάτιου τραυματισμού στο βακτήριο L. monocytogenes υπό διαφορετικές συνθήκες που σχετίζονται με το περιβάλλον επεξεργασίας τροφίμων όπως και η μελέτη των φαινοτυπικών και μοριακών χαρακτηριστικών των υποθανάτια τραυματισμένων κυττάρων. Για την επίτευξη αυτών των στόχων, η προσέγγιση που ακολουθήθηκε, σε πρώτο στάδιο, ήταν να ποσοτικοποιηθεί ο υποθανάτιος τραυματισμός υπο διάφορετικές συνθήκες καταπόνησης που απαντώνται στο περιβάλλον επεξεργασίας τροφίμων. Οι φαινότυποι που διερευνήθηκαν στα τραυματισμένα κύτταρα L. monocytogenes ήταν η μολυσματικότητα in vitro και η ικανότητα προσκόλλησης σε επιφάνειες. Αξιολογήθηκαν επίσης η μεταγραφή γονιδίων σχετικών με την μολυσματικότητα και την απόκριση σε καταπονήσεις. Τέλος, μελετήθηκε η επίδρασή της θερμοκρασίας προκαλλιέργειας των κυττάρων στην επιβίωση και τον τραυματισμό του L. monocytogenes σε συνθήκες καταπόνησης καθώς και το δυναμικό ανάπτυξης των κυττάρων μετά από καταπόνηση. Τα αποτελέσματα του κεφαλαίου 2, έδειξαν ότι οι αντιμικροβιακοί παράγοντες, που στοχεύουν στην εξάλειψη του παθογόνου, μπορούν να προκαλέσουν υποθανάτιο τραυματισμό, καθώς και ότι κάθε είδος καταπόνησης (υπεροξυκό οξύ, χλωριούχο βενζαλκόνιο, γαλακτικό οξύ, θέρμανση, καταπόνηση απο έλλειψη θρεπτικών συστατικών, ωσμωτική καταπόνηση) είχε διαφορετικό αντίκτυπο στην επιβίωση και την κινητική τραυματισμού των L. monocytogenes ScottA και EGDe. Τα υψηλότερα επίπεδα τραυματισμού σημειώθηκαν από το απολυμαντικό υπεροξικό οξύ (Peracetic acid, PAA). Έπειτα ακολουθήσε το γαλακτικό οξύ και η θέρμανση. Η θερμοκρασία έκθεσης (4oC και 20oC) επηρέασε την κινητική θανάτωσης αλλά και τραυματισμού του L. monocytogenes. Επιπλέον, η προσαρμογή των κυττάρων σε μέσο υψηλής αλατότητας χωρίς θρεπτικά συστατικά επηρέασε την αποτελεσματικότητα των απολυμαντικών υπεροξικό οξύ και χλωριούχο βενζαλκόνιο στην ικανότητα τους να προκαλούν θανάτωση αλλά και τραυματισμό. Τα αποτελέσματα του κεφαλαίου 3, έδειξαν ότι τα κύτταρα L. monocytogenes που έχουν τραυματιστεί από PAA διατηρούν σημαντικές ιδιότητες της φυσιολογίας τους. Τα τραυματισμένα κύτταρα παραμένουν ικανά να προσκολλώνται (μετά από 2 και 24 ώρες) σε επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα στους 4oC και 20oC. In vitro πειράματα παθογένειας χρησιμοποιώντας κύτταρα Caco-2 του ανθρώπινου εντερικού επιθηλίου έδειξαν ότι τα τραυματισμένα κύτταρα L. monocytogenes μπόρεσαν να εισβάλουν στα κύτταρα ξενιστές αλλά δεν μπόρεσαν να πολλαπλασιαστούν ενδοκυτταρικά. Η επώαση των τραυματισμένων κυττάρων L. monocytogenes ScottA σε υγρό θρεπτικό μέσο στους 4oC, είχε ως αποτέλεσμα τη θετική ρύθμιση των γονιδίων παθογένειας flaA, inlA και plcA. Επιπλέον, διαστελεχιακές διαφορές παρατηρήθηκαν στο δυναμικό παθογένειας των τραυματισμένων κυττάρων. Στο κεφάλαιο 4, διερευνήθηκαν το δυναμικό ανάπτυξης μεμονωμένων κυττάρων μετά από καταπόνηση και τραυματισμό, καθώς και η επίδραση της θερμοκρασίας ανάπτυξης των κυττάρων στον τραυματισμό. H προκαλλιέργεια κυττάρων στους 20oC και στους 4οC (συγκριτικά με τα κύτταρα που αναπτύχθηκαν στη βέλτιστη θερμοκρασία των 30oC) συνδέθηκε με μεγαλύτερα επίπεδα τραυματισμού κατά την έκθεση σε PAA-20oC και PAA-4oC αντίστοιχα. Η καταπόνηση και ο τραυματισμός από την έκθεση σε PAA επηρέασαν το δυναμικό ανάπτυξης του L. monocytogenes σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων. Συγκεκριμένα, οι χρόνοι ανάπτυξης, σε υγρό θρεπτικό μέσο ήταν μεγαλύτεροι και έδειξαν υψηλή παραλλακτικότητα. Συμπερασματικά, η διατριβή αυτή έχει στόχο να αναδείξει τη σημασία του υποθανάτιου τραυματισμού στον L. monocytogenes αλλά και τις συνέπειες που έχει για την ασφάλεια των τροφίμων. Τα ευρήματα υπογραμμίζουν ότι ο παθογόνος μικροοργανισμός, μετά από μια αντιμικροβιακή καταπόνηση μπορεί να επιβιώσει σε κατάσταση υποθανάτιου τραυματισμού, διατηρώντας παράλληλα σημαντικά λειτουργικά χαρακτηριστικά που του επιτρέπουν να επιβιώσει στο περιβάλλον επεξεργασίας τροφίμων και δυνητικά να προκαλέσει ασθένεια. Η παραλλακτικότητα στο δυναμικό ανάπτυξης των τραυματισμένων κυττάρων μπορεί να επηρεάσει την αποτελεματικότητα των μεθόδων ανίχνευσής τους. Τα ποσοτικά δεδομένα αυτής της μελέτης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη μοντέλων πρόβλεψης υποθανάτιου τραυματισμού του παθογόνου. Τα αποτελέσματα σχετικά με τη φαινοτυπική και μεταγραφική απόκριση μπορούν να συμβάλουν στην καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν την απόκριση του τραυματισμένου L. monocytogenes εντός του ξενιστή αλλά και στο περιβάλλον επεξεργασίας τροφίμων.