Μοριακή ανάλυση μηχανισμών ανθεκτικότητας εντόμων υγειονομικής σημασίας και εχθρών καλλιεργειών στα εντομοκτόνα

Abstract

Ένας μεγάλος αριθμός εντόμων απειλεί τους τομείς της αγροτικής παραγωγής, προκαλώντας σημαντικές απώλειες των γεωργικών προϊόντων ετησίως, και της δημόσιας υγείας, μέσω ασθενειών που μεταδίδονται από φορείς. Η καταπολέμησή τους βασίζεται κυρίως στη χρήση χημικών εντομοκτόνων, όμως η πίεση επιλογής που υφίστανται, συχνά οδηγεί στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας. Ένας πολύ σημαντικός γεωργικός εχθρός είναι ο δάκος της ελιάς, Bactrocera oleae, ο οποίος προκαλεί πολύ σοβαρές ποιοτικές και ποσοτικές ζημιές στην ελαιοπαραγωγή, εάν δεν τεθεί υπό έλεγχο. Τα κουνούπια αποτελούν μία ομάδα εντόμων υγειονομικής σημασίας, η οποία ευθύνεται για τη μετάδοση πολύ σοβαρών ασθενειών όπως η ελονοσία, ο δάγκειος πυρετός, ο ιός του Δυτικού Νείλου κ.α.. Ο έλεγχος των ασθενειών που μεταδίδονται από κουνούπια στηρίζεται κυρίως στον έλεγχο του φορέα. Η καταπολέμηση του δάκου της ελιάς και των κουνουπιών στηρίζεται κυρίως στη χρήση εντομοκτόνων. Εν τούτοις, η συχνή και εκτεταμένη χρήση περιορισμένου αριθμού διαθέσιμων εντομοκτόνων έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας, και στις δύο περιπτώσεις, υπονομεύοντας την αποτελεσματικότητα των επεμβάσεων καταπολέμησης. Η μελέτη των μηχανισμών ανθεκτικότητας και η παρακολούθηση της εξέλιξής της στους πληθυσμούς, αποτελούν πολύ σημαντικά στοιχεία της διαχείρισής της και κατ’ επέκταση της διαφύλαξης της αποτελεσματικότητας των εντομοκτόνων. Σε αυτή την κατεύθυνση, στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε παρακολούθηση της κατάστασης και της εξέλιξης της ανθεκτικότητας ελληνικών πληθυσμών του δάκου της ελιάς στις κύριες ομάδες εντομοκτόνων που χρησιμοποιούνται τα τελευταία χρόνια για την καταπολέμησή του (οργανοφωσφορικά, πυρεθροειδή, σπινοσίνες). Με κλασσικές εργαστηριακές βιοδοκιμές τοξικότητας ελέγχθηκαν τα επίπεδα ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα alpha-cypermethrin και spinosad, τα οποία βρέθηκαν αρκετά αυξημένα στην περίπτωση του alpha-cypermethrin. Με βιοδοκιμές που έλαβαν χώρα στον αγρό, επιβεβαιώθηκε η μειωμένη αποτελεσματικότητα στο alpha-cypermethrin και σε πραγματικές συνθήκες πεδίου, η οποία είχε προηγουμένως παρατηρηθεί με κλασικές εργαστηριακές βιοδοκιμές. Τέλος, η εφαρμογή μοριακών διαγνωστικών μεθόδων για τον έλεγχο της συχνότητας γνωστών μεταλλαγών ανθεκτικότητας του δάκου στα οργανοφωσφορικά εντομοκτόνα, έδειξε ότι οι μεταλλαγές G488S και I214V στο γονίδιο της ακετυλοχολινεστεράσης είναι εγκαθιδρυμένες στους περισσότερους πληθυσμούς, ενώ η Δ3Q έλλειψη βρέθηκε σε πολύ χαμηλές συχνότητες. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε διερεύνηση του μηχανισμού ανθεκτικότητας του δάκου στα πυρεθροειδή εντομοκτόνα. Βιοδοκιμές τοξικότητας με το εντομοκτόνο alpha-cypermethrin και τον αναστολέα δράσης P450 μονοξυγενασών (PBO) έδειξαν την εμπλοκή των P450 μονοοξυγενασών στην ανθεκτικότητα στο alpha-cypermethrin. Έπειτα, από ανάλυση μεταγραφώματος, προέκυψε ένας αριθμός γονιδίων αποτοξικοποίησης που υπερεκφράζονται σε ανθεκτικούς πληθυσμούς σε σχέση με ευαίσθητους, εκ των οποίων το μεγαλύτερο ποσοστό ήταν μέλη της ομάδας των P450 μονοοξυγενασών. Για δύο από αυτές (CYP6A23, CYP6G2), έγινε διερεύνηση του λειτουργικού τους ρόλου με χρήση της τεχνολογίας της RNA παρεμβολής. Η μείωση της έκφρασής της CYP6A23 απέδωσε περισσότερη ευαισθησία στο εντομοκτόνο alpha-cypermethrin, ενώ στην περίπτωση της CYP6G2 δεν υπήρξε κάποια αλλαγή. Επιπροσθέτως, διερευνήθηκε ο μηχανισμός της ανθεκτικότητας διείσδυσης στο κουνούπι Anopheles gambiae, το οποίο αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους φορείς της ελονοσίας παγκοσμίως. Υπολογίστηκε ο ρυθμός διείσδυσης του πυρεθροειδούς εντομοκτόνου deltamethrin σε ανθεκτικά κουνούπια, όπου βρέθηκε μειωμένος, σε σχέση με ευαίσθητα. Ποσοτική ανάλυση των υδρογονανθράκων του επιδερμιδίου σε ολόκληρα σώματα και σε πόδια ανθεκτικών κουνουπιών σε σχέση με ευαίσθητα, υπέδειξε διαφορές στη σύνθεση του επιδερμιδίου, φανερώνοντας συσχέτιση με την ανθεκτικότητα διείσδυσης των εντομοκτόνων στο Anopheles gambiae. Επιπλέον, εκτίμηση της πληθυσμιακής σύστασης και ανθεκτικότητας σε πληθυσμούς κουνουπιών-φορέων ασθενειών, πραγματοποιήθηκε στο νησί της Κρήτης. Με βάση μορφολογική αναγνώριση και μοριακή ταυτοποίηση, βρέθηκε ότι η πληθυσμιακή κοινότητα των κουνουπιών της Κρήτης περιλαμβάνει σημαντικούς φορείς ασθενειών, με το είδος Culex pipiens (κύριος φορέας του ιού του Δυτικού Νείλου) να κυριαρχεί. Η εφαρμογή μοριακών διαγνωστικών μεθόδων για τoν έλεγχο της παρουσίας μεταλλαγών ανθεκτικότητας στα πυρεθροειδή εντομοκτόνα και στο ρυθμιστή ανάπτυξης diflubenzuron, έδειξαν ότι οι γνωστές μεταλλαγές ανθεκτικότητας στα πυρεθροειδή εντομοκτόνα βρίσκονται σε υψηλές συχνότητες στους πληθυσμούς Cx. pipiens, και σε χαμηλές έως μέτριες συχνότητες στους πληθυσμούς Aedes albopictus. Η μεταλλαγή Ι1043Μ ανθεκτικότητας στο diflubenzuron, αν και σε μικρό ποσοστό, ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά σε άτομα του είδους Cx. pipiens από το Λασίθι. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής έδειξαν ότι η ανθεκτικότητα στους πληθυσμούς του δάκου στο πυρεθροειδές εντομοκτόνο alpha-cypermethrin και στα οργανοφωσφορικά εντομοκτόνα έχει εξελιχθεί στην Ελλάδα. Η ανθεκτικότητα του δάκου στο alpha-cypermethrin έχει αρνητικό αντίκτυπο στις εφαρμογές στο πεδίο, ενώ στο μηχανισμό ανθεκτικότητας εμπλέκονται οι P450 μονοοξυγενάσες. O μηχανισμός της επιδερμικής ανθεκτικότητας (μειωμένης διείσδυσης εντομοκτόνων) είναι υπαρκτός στον φορέα της ελονοσίας An. gambiae, και βασίζεται σε αλλαγές στη σύσταση του επιδερμιδίου, όπως την αυξημένη εναπόθεση υδρογονανθράκων. Τέλος, η πληθυσμιακή σύνθεση των κουνουπιών της Κρήτης περιλαμβάνει σημαντικούς φορείς ασθενειών, οι οποίοι σε ένα μεγάλο ποσοστό φέρουν μεταλλαγές ανθεκτικότητας στα πυρεθροειδή εντομοκτόνα, και επιπλέον ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά σε άτομα Culex pipiens μία από τις μεταλλαγές ανθεκτικότητας στο diflubenzuron.

A number of insects pose a threat in agricultural production, as they cause significant crop losses annually as well as, they threaten public heath by transmitting vector-borne diseases. Insect control is undertaken via the use of chemical insecticides, where selection pressure often results to insecticide resistance emergence. A major agricultural pest is the olive fly, Bactrocera oleae, producing serious qualitative and quantitative losses in olive production. Mosquitoes comprise a group of insects that threaten public health as they are responsible for the transmission of severe diseases like malaria, Dengue fever and West Nile virus. The prevention of these diseases is primarily based on the control of the mosquito-vectors. Olive flies and mosquitoes are mainly controlled by the use of insecticides. Nevertheless, the frequent and extensive use of a limited number of insecticides has led to the development of insecticide resistance, thus eroding the efficacy of control applications. Resistance monitoring and investigation of the underlying molecular mechanisms are major components of insecticide resistance management, thus preserving the insecticides’ efficacy as well. In this direction, the status and evolution of resistance in major classes of insecticides used in the main control programs (organophosphates, pyrethroids, spinosyns) were monitored, in olive fly populations from Greece. Using topical toxicity bioassays, the levels of resistance in alpha-cypermethrin and spinosad were assessed, and reduced efficacy of alpha-cypermethrin was evident. Field bioassays results were in agreement with laboratory bioassays. Furthermore, molecular diagnostics were applied for the detection of organophosphate resistance mutation, and the results showed that in acetyl-cholinesterase (AChE), the known target-site mutations (G488S and I214V) are fixed in most populations tested, but the Δ3Q deletion was found in very low frequencies. In addition, the molecular mechanism of pyrethroid resistance was investigated in the olive fly. Toxicity bioassays with alpha-cypermethrin and a known P450 monooxygenase inhibitor (PBO) indicated the involvement of P450s in resistance to alpha-cypermethrin. Furthermore, transcriptomic analyses revealed a number of detoxification being overexpressed in resistant populations, when compared to susceptible ones, with the majority of them belonging to the P450 group of enzymes. Two of those P450s (CYP6A23, CYP6G2) where functionally validated using the RNA interference technology. The reduction of CYP6A23 expression levels led to an increase of sensitivity to alpha-cypermethrin, but in the case of CYP6G2, no changes were observed. The molecular mechanism of cuticular/penetration resistance in the major malaria vector, Anopheles gambiae, were also investigated. Penetration rate of the pyrethroid insecticide deltamethrin was evaluated, in resistant mosquitoes when compared with susceptible ones, where reduction of the insecticides’ penetration was observed. Quantitative analysis of the cuticular hydrocarbons in hole bodies and legs of resistant mosquitoes versus susceptible mosquitoes was performed, where differences in cuticular composition were depicted, indicating an adaptation contributing in insecticide resistance. Finally, the populational composition and the insecticide resistance status in mosquito-vector populations from the island of Crete, was monitored. Based on morphological and molecular identification, the mosquito fauna of Crete comprises of several vectors of serious diseases, with Culex pipiens (major vector of West Nile virus), by far being the most dominant species across the island. Molecular diagnostics were applied for the detection of pyrethroid and diflubenzuron resistance mutations. Cx. pipiens and Aedes albopictus mosquitoes both harboured mutations associated with pyrethroid resistance, with Cx. pipiens having high frequencies while A. albopictus maintaining low to moderate frequencies. In addition, the diflubenzuron resistance mutation, Ι1043Μ, was detected in low frequency, but for the first time, in a Cx. pipiens population from Lassithi. In conclusion, the results of the present study showed that resistance in the populations of olive fruit fly to the pyrethroid insecticide alpha-cypermethrin and to organophosphate insecticides has evolved in Greece. Resistance of the olive fruit fly to alpha-cypermethrin has a negative impact on field applications, and P450 monooxygenases are involved in the resistance mechanism. The mechanism of cuticular/penetration resistance (reduced insecticide penetration) is present in the malaria vector An. gambiae, and is based on changes in epidermis composition, such as increased deposition of hydrocarbons. Finally, the population composition of mosquitoes in Crete includes important disease vectors, which in a large proportion carry resistance mutations to pyrethroid insecticides, and in addition, one of the resistance mutations to diflubenzuron was detected for the first time in Cx. pipiens individuals.